血管發生抑制分子及其在癌症治療和診斷中的用途的製作方法
2023-10-22 16:53:27
專利名稱：血管發生抑制分子及其在癌症治療和診斷中的用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及能夠抑制血管發生的分子、包含一種或多種所述分子的治療或診斷組合物、以及這些分子在醫學中的用途，特別是在治療或診斷癌症(特別是實體瘤)中的用途。還公開了用於提供這些分子的方法。
血管發生(即由原有脈管系統形成新的血管)是創傷癒合、生殖和胚胎發育的基礎。血管發生對於腫瘤的發生也是至關重要的。腫瘤中的新血管提供養分，容許細胞進行不受控制的有絲分裂。
在血管發生過程中，內皮細胞增殖，遷移到新組織中，並形成內皮間連接，導致管的形成。這個過程是由血管生成因子起始和驅動的。VEGF和促血管生成素(angiopoietin)的信號作用導致外膜細胞-內皮接觸放鬆，從而容許新內皮細胞增殖並通過整聯蛋白的介導與胞外基質相互作用。αvβ3和αvβ5整聯蛋白已被描述經由與血管生成因子的信號交叉對話(crosstalk)而參與血管發育和血管發生。
除了內皮細胞與胞外基質之間的相互作用以外，內皮間接觸的調節對於管的形成也是重要的。例如，粘附分子VE-鈣粘著蛋白在血管重建(remodelling)中發揮作用，且維持血管的完整性。
在產生本發明的研究中，發現了連接粘附分子JAM-B和JAM-C。這些分子是在血管細胞-細胞接觸中發現的，且牽涉白細胞跨內皮遷移。現在發現JAM-B和JAM-C之間的相互作用在血管發生中也發揮重要作用。
根據這項發現，發明人試圖尋找能夠抑制血管發生的新分子。為此，他們使用了包括下列步驟的方法a)提供一系列分子；b)測試這些分子是否能夠防止JAM-B和JAM-C之間的相互作用；c)對陽性分子測試它們在體內阻斷血管發生的能力；並
d)選擇在體內測試中呈陽性的分子作為血管發生抑制分子。
對分子測試它們在體內阻斷血管發生的能力可以如實施例4中所述通過視網膜測試進行。
依照本發明發現並非所有能夠防止JAM-B和JAM-C之間相互作用的分子也能夠抑制血管發生。因此，額外的上述步驟d)的測試是尋找期望分子所必需的。
根據本發明，為了尋找特別適合的分子，該方法還可以包括對陽性分子測試它們在體內抑制腫瘤生長的能力的步驟。在體內抑制腫瘤生長的測試是例如實施例5中描述的測試方法。
通過分離或生成血管發生抑制分子的步驟可以實際獲得期望的分子。
可以在這種方法中測試的一系列分子可以是不同的。合適地，所述的一系列分子可以是例如針對JAM-B或JAM-C的一群抗體。抗體製備是不需要創造性技能的簡單技術，例如在khler和Milstein，Nature 256495-497(1975)中所描述的。因此，技術人員將能夠在沒有過度負擔下提供該系列分子。
測試分子是否能夠防止JAM-B和JAM-C之間的相互作用是通過例如在存在所述分子的條件下分別將在表面表達JAM-B或JAM-C的細胞與標記的可溶性JAM-C或JAM-B溫育並記錄相對於不含所述分子進行的對照溫育的細胞標記減少而進行的。選擇與表達JAM-C或JAM-B且具有標記的JAM-B或JAM-C但沒有被測試分子結合到其表面的對照細胞相比誘導標記物顯現數量減少的分子作為陽性分子。
合適的標記物有本領域眾所周知的基於螢光、放射性或生物素的標記物。用於顯現標記物及其消失或減少的合適技術有流式細胞術、生物化學或酶聯免疫吸附測定法(ELISA)。
然後對發現抑制3AM-B和JAM-C之間相互作用的分子進一步測試它們在體內抑制血管發生的能力。為此可以採用多種選擇。然而，實施例4中描述的視網膜測試是非常適合的，因為血管系統的重建本質上依賴內皮細胞而非微環境因素。另外的測試方法有絨毛膜尿囊膜測定法(chorio allantois membrane assay)、缺血性再灌注(ischemicreperfusion)或由荷載了血管生成因子的基底膜基質(matrigel)移植物誘導的血管發生。這些測試方法在本領域是眾所周知的。
除了測試在體內抑制血管發生的能力以外，還/或者可以測試分子在體內抑制腫瘤生長的能力。這種測試的合適實例如實施例5中所述。
上述方法最終導致鑑定了由雜交瘤13H33生成的抗體H33作為本發明血管發生抑制分子，所述雜交瘤13H33於2003年10月22日保藏於Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，保藏編號DSM ACC2622。證明了針對JAM-C的抗體H33能夠在體外和在體內阻斷血管發生且在體內防止腫瘤生長。它減少巨噬細胞進入腫瘤的募集。它還阻斷JAM-C與JAM-B的相互作用。H33不影響增殖和凋亡。
因此，本發明涉及用作藥物，特別是用於治療癌症，更具體的說就是用於治療實體瘤的抗體H33。另外，本發明涉及用作藥物的與H33具有相同特異性的H33片段和衍生物。具體而言，這些片段和衍生物就是Fab片段、Fv片段、單個結構域抗原結合片段、具有H33特異性的重組抗體、scFv及其聚集體、VHHs、H33的人源化衍生物、至少包含H33特異性的嵌合抗體或具有H33特異性的人單克隆抗體。後者適於在轉基因小鼠或其它動物中生成(下文將進行解釋)。
本發明還涉及同樣保留完整抗體的抗原結合能力的抗體片段和抗體衍生物。本領域從未描述過H33的這些片段和衍生物，因而它們是新穎的。
可以通過對抗體的蛋白水解(木瓜蛋白酶消化、胃蛋白酶消化或其它酶促方法)改造功能性抗原結合抗體片段，產生Fab、Fv或單個結構域。
或者，可以重組生產片段。Fab片段(「抗原結合片段」)是抗體分子的抗原結合結構域，包含VH+CH1和CL+VL。CL和CH1之間存在一個鏈間二硫鍵。該異二聚體的分子量通常是大約50kDa。可以通過用木瓜蛋白酶消化完整抗體來製備Fab片段。
仍然包含完整IgG抗體的完整抗原結合位點的最小片段(～30kDa)由重鏈可變結構域(VH)和輕鏈可變結構域(VL)二者組成。稱為Fv片段(「可變片段」)的這種異二聚體仍然能夠結合抗原。
另一種片段是單個結構域抗原結合片段(dAbs)或VHs。
可以重組生成單鏈Fv片段。在scFv片段中，VH和VL結構域以親水性且柔性肽接頭相連。scFv能夠複合形成二聚體(二體，diabody)、三聚體(三體，triabody)或更大聚合物，其中單體單元可以具有相同或不同的特異性。
另一種類型的抗體片段是包含最小可用完整抗原結合片段的VHHs。可以通過經免疫駱駝(immunised camelid)重鏈抗體的蛋白水解或重組技術生成VHHs。
在使用重組DNA技術時，基本上可以將編碼H 33抗體H鏈或L鏈V結構域的多核苷酸與編碼優選人H或L鏈恆定區的多核苷酸融合。為了表達以這種方式獲得的完整H和L鏈，還可以添加編碼容許蛋白質分泌的信號肽的序列。
為了生成本發明的血管發生抑制分子，使用了表達盒，其中將本發明的融合多核苷酸與容許在選定宿主細胞中調控其轉錄和翻譯的適當控制序列以及包含多核苷酸或這種表達盒的重組載體相連。
因此，不但可以通過眾所周知重組DNA技術的方法也可以通過化學DNA合成容易地獲得本發明的多核苷酸，即具有H33特異性的血管發生抑制分子。
可以通過重組DNA和遺傳工程的眾所周知的技術獲得重組DNA構建體並導入宿主細胞。
在本發明中有用的宿主細胞可以是原核或真核細胞。在合適的真核細胞中，可以提到例如植物細胞、酵母細胞(諸如酵母屬(Saccharomyces))、昆蟲細胞(諸如果蠅屬(Drosophila)或夜蛾屬(Spodoptera))和哺乳動物細胞(諸如HeLa、CHO、3T3、C127、BHK、COS等)。
有幾種方法可用於用包含編碼嵌合Ig鏈的核酸構建體的載體轉染原核或真核細胞。將載體導入淋巴樣細胞的一種優選方法是球芽融合(見例如Gillies等，1989，Biotechnol.7798-804)。另外的方法包括電穿孔或磷酸鈣沉澱。用於生成免疫綴合物的其它有用方法包括製備編碼構建體的RNA序列並在適當的體內或體外系統中進行翻譯。
一旦表達，可以通過標準蛋白質純化過程收穫本發明的蛋白質(見例如美國專利號5,650,150)。
在將重鏈和輕鏈組合在本發明的分子中時，優選在相同的細胞中與相應輕鏈共表達抗體可變區的重鏈。對於包含多個多肽鏈的融合蛋白，可以使用一種以上的表達載體。使用例如兩種表達載體的共轉染方法常常導致將兩種載體都投遞到靶細胞中。或者，使用編碼多個多肽的單一載體在相同細胞中進行共表達有時是有效的。
另外，可以方便地將本發明的蛋白質表達成單鏈分子。例如，可以將抗體可變區表達成單鏈抗體或sFv，任選與非免疫球蛋白的蛋白質融合。在另一個實施方案中，將重鏈(含有或不含融合的細胞因子)與輕鏈(或重鏈)配對物(含有或不含融合的細胞因子)組合在一起而形成單價和二價免疫綴合物。
根據VL和VH區的核酸序列是如何構建的，它們可以通過二硫鍵或肽鍵相連。一般而言，當V區的序列是在分開的DNA構建體上編碼時，它們通過二硫鍵相連。相反，當V區的序列是在單鏈DNA構建體上編碼時，它們通常通過肽鍵相連。
在本發明的某些實施方案中，輕鏈可變區和重鏈可變區可以分別與免疫球蛋白的輕鏈恆定區和重鏈恆定區結合。可以使用免疫球蛋白輕鏈恆定區的κ或λ鏈。
可以通過分子生物學的標準技術來進行本發明表達載體的構建和宿主細胞的轉化。
可以通過使用蛋白A Sepharose的親和層析由細胞或培養物上清液純化由這些原核或真核細胞生成的本發明血管發生抑制分子，並通過眾所周知的競爭性ELISA技術通過測量它們針對H33結合包被在微量滴定板上的可溶性JAM-C的抑制活性來評估它們的JAM-C結合活性。
剩餘的大鼠可變結構域在人體中可能仍然具有免疫原性，從而能夠削弱基於抗體療法的功效。可以應用眾所周知的方法來降低免疫原性，諸如「鑲飾術(veneering)」和「人源化」，它們牽涉如專利WO 2004055056中所述引入胺基酸替代。然後可以如上所述通過針對H33的抑制活性來進行對結合親和力的篩選。
或者，可以突變非人T細胞表位，使得它們符合人類抗體中存在的人類自身表位(見例如美國專利號5,712,120)。H33抗體是本發明的一部分，其具有包括至少一個人源化序列的VL和VH區，從而在施用於人時降低免疫原性。
然後可以如上所述進行宿主細胞中的抗體生成和純化。
依照本發明的另一方面，可以將H33的抗體可變區或類似分子與非免疫球蛋白部分相連，其中含有或不含插入Fc部分。具體而言，非免疫球蛋白部分可以是細胞因子(諸如白細胞介素)、造血因子、淋巴因子、幹擾素或趨化因子。白細胞介素可以是例如白細胞介素-2或白細胞介素-12。造血因子和淋巴因子可以分別是例如粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)和淋巴毒素。幹擾素可以是例如幹擾素-α、幹擾素-β或幹擾素-γ。
在本發明的有些實施方案中，融合蛋白包含另一非免疫球蛋白部分，諸如另一細胞因子。
本發明還提供了H33抗體或其片段或衍生物用於製備用於在患者中防止JAM-B/JAM-C相互作用的藥物的用途。
這種防止作用可以包括通過對患者施用具有本發明可變區的抗體而靶向表面具有JAM-C的細胞。在一個實施方案中，被靶向的細胞是腫瘤細胞。
依照本發明的其它方面，防止JAM-C/JAM-B相互作用可以通過對患者施用編碼抗體可變區的核酸或包含該核酸的細胞之任一來實現。
對於人體臨床應用，修飾大鼠來源的抗體H33以降低抗體的免疫原性或將其降至最低可能是有用的。作為降低鼠源抗體免疫原性的手段，文獻中已經報告了多種方法。這些方法包括生成包含鼠或大鼠可變區和人恆定區的嵌合抗體、生成包含來自鼠或大鼠抗體的可變結合序列的單鏈抗體、生成鼠或大鼠的抗原結合片段(因為它們較小，所以可能免疫原性較低)、生成人單克隆抗體和生成「人源化」抗體。
人源化理想地提供了沒有免疫原性且完全保持親本非人抗體分子的抗原結合特性的抗體。沒有免疫原性容許施用多個劑量而不會產生不利的免疫原性反應。文獻中已經報告了用於生成人源化抗體的多種方法。例如，可以如下生成人源化抗體(a)只將非人CDR移植到人構架和恆定區上(Jones等，Nature 321522-25，1986；Verhoeyen等，Science 2391534-1536，1988)；或者(b)移植整個非人可變結構域(以保持配體結合特性)但也通過對暴露殘基的替代用人樣表面「掩飾」它們以降低免疫原性(也稱為「鑲飾」抗體)(Padlan，Molec.Immun.28489-498，1991；Padlan，Molec.Immun.31(3)169-217，1994)。
據報導，在人可變區構架結構域中保持非人(鼠或大鼠)殘基有助於保持產生的人源化抗體的適當結合功能。據報導，人源化抗體潛在降低或消除抗體在宿主接受者中的免疫原性，從而容許提高生物利用度並降低不利免疫反應的可能性，從而潛在能夠進行多次抗體施用。同樣，上述衍生自具有期望結合特異性的抗體的scFv和諸如Fv、Fd、Fab、Fab′和F(ab)′2片段等抗體片段的合成構成了生成免疫原性比完整抗體低的靶向部分的另一種已知方法。本質上，單鏈抗體和抗體片段因為較小，所以免疫原性可能比完整抗體低。
還知道，重組蛋白(例如抗體)在用於表達的不同宿主細胞中發生的糖基化不同。對於H33抗體的臨床應用，糖基化可以延長它的半衰期和/或降低它的免疫原性。
抗體H33還可用於競爭性篩選以分離與H33具有相同或相似特異性的「人單克隆抗體」或「重組人抗體」。基本上，由此分離的人抗體可以在能夠通過進行V-D-J重組和同種型轉換而生成針對JAM-C的多種同種型人單克隆抗體(例如IgG、IgA和/或IgE)的雜交瘤、轉染瘤或非人轉基因動物(例如轉基因小鼠)中生成(例如專利EP1471938和US 2004208873)。這種轉基因動物還可以是用於生成多克隆抗體的轉基因兔，諸如US 2003/0017534中所述。
術語「人單克隆抗體」指具有衍生自人種系免疫球蛋白序列的可變區和恆定區且展示單一結合特異性的抗體。在一個實施方案中，通過包含由轉基因非人動物(例如轉基因小鼠)(具有包含人重鏈轉基因和輕鏈轉基因的基因組)獲得的B細胞與無限增殖化細胞融合的雜交瘤生成了與H33具有相同特異性的人單克隆抗體。
用於製備雜交瘤的優選動物系統是鼠系統。小鼠中雜交瘤的產生是已經完善建立的方法。免疫方案和分離用於融合的經免疫脾細胞的技術在本領域是已知的。融合配偶體(例如鼠骨髓瘤細胞)和融合流程也是已知的。
在一個優選的實施方案中，可以使用攜帶人免疫系統部分而非小鼠系統的轉基因小鼠即所謂的「HuMAb」小鼠(Lonberg等，1994，Nature368(6474)856-859)來生成針對JAM-C且具有H33特異性的人單克隆抗體。因此，在該小鼠中，小鼠IgM或[κ]輕鏈的表達降低，而且導入的人重鏈和輕鏈轉基因應答免疫而進行類型轉換和體細胞突變，生成高親和力的人IgG[κ]單克隆抗體(Lonberg，N.等，1994，見上文；綜述見Lonberg，N.，1994，Handbook of ExperimentalPharmacology 11349-101；Lonberg，N.和Huszar，D.，1995，Intern.Rev.Immunol.Vol.1365-93；以及Harding，F.和Lonberg，N.，1995，Ann.N.Y.Acad.Sci.764536-546)。下列參考文獻詳細描述了HuMAb小鼠的製備Taylor，L.等，1992，Nucleic AcidsResearch 206287-6295；Chen，J.等，1993，InternationalImmunology 5647-656；Tuaillon等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 903720-3724；Choi等，1993，Nature Genetics 4117-123；Chen，J.等，1993，EMBO J.12821-830；Tuaillon等，1994，J.Immunol.1522912-2920；Lonberg，N.等，1994，Nature 368(6474)856-859；Lonberg，N.，1994，Handbook of Experimental Pharmacology11349-101；Taylor，L.等，1994，International Immunology 6579-591；Lonberg，N.和Huszar，D.，1995，Intern.Rev.Immunol.Vol.1365-93；Harding，F.和Lonberg，N.，1995，Ann.N.Y.Acad.Sci.764536-546；Fishwild，D.等，1996，Nature Biotechnology14845-851。還可參閱美國專利號5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,789,650、5,877,397、5,661,016、5,814,318、5,874,299和5,770,429(都是授予Lonberg，N.和Kay，R.M.以及GenPharn International的)；授予Surani等的美國專利號5,545,807；1998年6月11日公布的國際公布號WO 98/24884；1994年11月10日公布的WO 94/25585；1993年6月24日公布的WO 93/1227；1992年12月23日公布的WO 92/22645；以及1992年3月19日公布的WO 92/03918。
優選的HuMAb小鼠在它們的內源輕鏈(κ)基因中具有JKD破壞(disruption)(如Chen等，1993，EMBO J.12821-830所述)、在它們的內源重鏈基因中具有CMD破壞(如Korman等的WO 01/14424的實施例1所述)、具有KCo5人κ輕鏈轉基因(如Fishwild等，1996，Nature Biotechnology 14845-851所述)、且具有HCo7人重鏈轉基因(如Lonberg，N.和Kay，R.M.的美國專利號5,770,429所述)和/或HCo12人重鏈轉基因(如Korman等的WO 01/14424的實施例2所述)。
或者，可以使用在轉染色體(transchromosomic)片段上攜帶人免疫球蛋白基因的小鼠來生成具有H33特異性的抗JAM-C抗體。這種轉染色體小鼠的製備描述於Tomizuka等的WO97/07671。在優選的小鼠中，在轉基因上攜帶某些人免疫球蛋白基因，而在轉染色體上攜帶其它人免疫球蛋白基因，諸如Ishida等的WO 02/43478中詳細描述的攜帶人輕鏈轉基因(例如KCo5κ鏈轉基因)和人重鏈轉染色體(例如SC20轉染色體)的小鼠。
為了生成完全人的具有H33特異性的JAM-C單克隆抗體，可以如Lonberg，N.等，1994，Nature 368(6474)856-859；Fishwild，D.等，1996，Nature Biotechnology 14845-851；以及WO 98/24884所述，用JAM-C抗原和/或生成JAM-C的細胞和/或重組JAM-C的純化或富集製備物免疫HuMAb小鼠。優選的是，小鼠在第一次輸注時是6-16周齡。例如，可以用重組JAM-C腹膜內免疫HuMAb小鼠。
為了生成JAM-C的人單克隆抗體，可以分離小鼠脾細胞，並根據標準方案用PEG與小鼠骨髓瘤細胞系融合。然後通過眾所周知的技術對由此產生的雜交瘤篩選抗原特異抗體的生成。
還可以通過例如重組DNA技術與本領域眾所周知的基因轉染方法(Morrison，S.，1985，Science 2291202)的聯合，在宿主細胞轉染瘤中生成具有H33特異性的本發明人抗體。
H33及其具有防止JAM-B和JAM-C之間相互作用且在體內抑制血管發生的能力的片段或衍生物可用於本發明。抗體片段和抗體融合蛋白的生成綜述於Joosten，V.等，Microb Cell Fact 2(1)1，2003。用於製備抗體片段和衍生物的技術是眾所周知的，而且本領域技術人員可以無需過度負擔下進行。
例如，為了表達H33抗體或其抗體片段，可以通過標準分子生物學技術(例如PCR擴增、定點誘變)獲得編碼部分或全長輕鏈和重鏈的DNA，並且插入表達載體使得基因可操作連接轉錄和翻譯控制序列。在本文中，術語「可操作連接」意指將抗體基因連接到載體中使得載體中的轉錄和翻譯控制序列發揮它們預計的功能，即調控抗體基因的轉錄和翻譯。選擇的表達載體和表達控制序列應當與所用表達宿主細胞相容。
可以將抗體輕鏈基因和抗體重鏈基因插入分開的載體，或者更常見的是將兩種基因插入相同的表達載體。通過標準方法(例如抗體基因片段和載體上的互補限制位點的連接，或是如果沒有限制位點的話平端連接)將抗體基因插入表達載體。
可以使用本文所述抗體的輕鏈和重鏈可變區通過將它們插入已經編碼目的同種型重鏈恆定區和輕鏈恆定區的表達載體使得VH區段與載體中的CH區段可操作連接且VL區段與載體中的CL區段可操作連接來產生任何抗體同種型的全長抗體基因。
另外/或者，重組表達載體可以編碼促進宿主細胞分泌抗體鏈的信號肽。可以將抗體鏈基因克隆到載體中使得信號肽符合讀框地與抗體鏈基因的氨基末端相連。信號肽可以是免疫球蛋白的信號肽，或是異源信號肽(即來自非免疫球蛋白的蛋白質的信號肽)。
除了抗體鏈基因以外，本發明的重組表達載體還攜帶控制抗體鏈基因在宿主細胞中表達的調控序列。術語「調控序列」意圖包括啟動予、增強子和控制抗體鏈基因轉錄或翻譯的其它表達控制元件(例如多聚腺苷酸化信號)。這些調控序列見例如Goeddel，Gene ExpressionTechnology.Me thods in Enzymology 185，Academic Press，SanDiego，CA，1990。
本領域技術人員將領會，表達載體的設計(包括調控序列的選擇)可能取決於諸如待轉化宿主細胞的選擇、期望的蛋白質表達水平等因素。
用於哺乳動物宿主細胞表達的優選調控序列包括在哺乳動物細胞中指導高水平蛋白質表達的病毒元件，諸如衍生自巨細胞病毒(CMV)、猴病毒40(SV40)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期啟動子AdMLP)和多形瘤的啟動子和/或增強子。或者，可以使用非病毒調控序列，諸如泛素啟動子或β-球蛋白啟動子。
除了抗體鏈基因和調控序列以外，用於表達本發明血管發生抑制分子的重組表達載體還可以攜帶其它序列，諸如調控載體在宿主細胞中複製的序列(例如複製起點)和選擇標記基因。選擇標記基因便於選擇導入了載體的宿主細胞(見例如美國專利號4,399,216、4,634,665和5,179,017，都授予Axel等)。例如，選擇標記基因通常賦予導入了載體的宿主細胞以藥物(諸如G418、潮黴素或氨甲蝶呤)抗性。優選的選擇標記基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(用於dhfr-宿主細胞的氨甲蝶呤選擇/擴增)和neo基因(用於G418選擇)。
為了表達輕鏈和重鏈，通過標準技術將編碼重鏈和輕鏈的表達載體轉染到宿主細胞中。各種形式的術語「轉染」意圖涵蓋常用於將外源DNA導入原核或真核宿主細胞的多種技術，例如電穿孔、磷酸鈣沉澱、DEAE-葡聚糖轉染。雖然理論上有可能在原核或真核宿主細胞中表達本發明的分子，優選在真核細胞中進行表達，最優選哺乳動物宿主細胞，因為這些真核細胞(特別是哺乳動物細胞)比原核細胞更有可能組裝和分泌正確摺疊且有免疫學活性的抗體、其片段或衍生物。
用於表達本發明的重組抗體的優選哺乳動物宿主細胞包括CHO細胞(包括dhfr-CHO細胞，描述於Urlaub和Chasin，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 774216-4220，與DHFR選擇標記配合使用，如例如R.J.Kaufman和P.A.Sharp，1982，Mol.Biol.159601-621所述)、NS/0骨髓瘤細胞、COS細胞、HEK293細胞和SP2.0細胞。特別是在使用NS/0骨髓瘤細胞時，另一種優選的表達系統是WO 87/04462、WO 89/01036和EP 338 841中公開的GS(穀氨醯胺合成酶)基因表達系統。在將編碼抗體基因的重組表達載體導入哺乳動物宿主細胞後，通過將宿主細胞培養足以容許宿主細胞表達產物或更優選的是將產物分泌到宿主細胞所生長的培養基中的時間來生成表達產物。可以使用標準蛋白質純化方法由培養物的培養基回收表達產物。
或者，可以在其它表達系統中表達克隆的抗體基因，包括原核細胞，諸如微生物，例如用於生成scFv抗體的大腸桿菌(E.coli)、藻類(algi)、以及昆蟲細胞。另外，可以在轉基因非人動物(諸如在綿羊和兔的乳汁中或雞的卵中)或者是轉基因植物中生產抗體。見例如Verma，R.等，1998，Antibody engineeringComparison ofbacterial，yeast，insect and mammalian expression systems.J.Immunol.Meth.216165-181；Pollock等，1999，Transgenicmilkas a method for the production of recombinant antibodies.J.Immunol.Meth.231147-157；以及Fischer，R.等，1999，Molecularfarming of recombinant antibodies in plants.Biol.Chem.380825-839。
抗體主要通過位於六個重鏈和輕鏈互補決定區(CDR)中的胺基酸殘基與靶抗原相互作用。為此，CDR內的胺基酸序列在各個抗體之間比CDR以外的序列變化更多。因為CDR序列負責大多數抗體-抗原相互作用，所以有可能通過構建表達載體來表達模擬特異天然存在抗體的特性的重組抗體，所述的表達載體包含來自該特異天然存在抗體(在這種情況中，具體的說就是H33)的CDR序列，其被移植到來自具有不同特性的不同抗體的構架序列上(見例如Riechmann，L.等，1998，Nature 332323-327；Jones，P.等，1986，Nature 321522-525；以及Queen，C.等，1989，Proc.Natl.Acad.參見U.S.A.8610029-10033)。這些構架序列可以由包含種系抗體基因序列的公共DNA資料庫獲得。這些種系序列與成熟抗體基因序列有所不同，因為它們不包含B細胞成熟過程中通過V(D)J連接形成的完全組裝好的可變基因。種系基因序列還與高親和力次級全套(repertoire)抗體的序列有所不同，後者在整個可變基因包含突變，但突變通常簇集在CDR中。例如，體細胞突變在構架區1的氨基末端部分和構架區4的羧基末端部分中相對稀有。另外，許多體細胞突變不顯著改變抗體的結合特性。
為此，為了重建與特定抗體具有相似結合特性的完整重組抗體，不必獲得該原始抗體的完整DNA序列(見WO 99/45962)。為此目的，跨越CDR區域的部分重鏈和輕鏈序列通常就已足夠。使用部分序列來確定哪些種系可變和連接基因區段有助於重組抗體可變基因。然後使用種系序列填充可變區中的缺失部分。重鏈和輕鏈前導序列在蛋白質成熟過程中切除，無助於最終抗體的特性。為了添加缺失的序列，可以將克隆的cDNA序列與合成寡核苷酸通過連接或PCR擴增組合在一起。或者，可以將整個可變區合成為一套短的、交疊的寡核苷酸，並通過PCR擴增組合在一起，產生完全合成的可變區克隆。這種方法具有某些優點，諸如消除或包含特定限制位點、或是優化特定密碼子。
在本申請中，術語「血管發生抑制分子」指H 33及其如本文所述保持相同或相似特異性的所有可能的片段和衍生物。
本發明還涉及血管發生抑制分子諸如H33及其片段和衍生物用於製備用於治療或診斷癌症特別是實體瘤的治療或診斷組合物的用途。
本發明還涉及用於治療或診斷癌症特別是實體瘤的治療或診斷組合物，其包含治療或診斷有效量的一種或多種本發明血管發生抑制分子以及合適的賦形劑、載體、稀釋劑或其它添加劑。癌症治療領域的技術人員將能夠確定治療或診斷有效量。
組合物還可以包含多種(例如兩種或多種)本發明血管發生抑制分子的組合。
還可以在聯合療法中施用本發明的藥物組合物，即聯合其它藥劑。例如，聯合療法可以包含至少一種化療劑、至少一種抗炎劑、或至少一種免疫抑制劑。
在另一個實施方案中，本發明的血管發生抑制分子可以連同放療一起施用。
在另一個實施方案中，本發明的血管發生抑制分子可以聯合一種或多種其它抗體一起施用，例如一種或多種人抗體，諸如抗VEGF抗體。
調整劑量方案以提供最佳的期望反應(例如治療反應)。例如，可以單次大劑量施用，可以隨時間施用幾個分開的劑量，或者可以根據治療情況的急需適當減少或增加劑量。配製劑量單位形式的腸胃外組合物以便於施用和劑量的一致是尤其有利的。劑量單位形式在用於本文時指適於以單一劑量用於待治療受試者的物理上離散單位；每個單位包含根據計算產生期望治療效果的預定數量的活性化合物以及所需藥物載體。本發明劑量單位形式的規格由下列各項規定和直接決定(a)活性化合物的獨特特徵和有待實現的特定治療效果；和(b)將這種活性化合物複合的技術對於在個體中的治療敏感性的內在限制。
短語「腸胃外施用」在用於本文時指腸和局部施用以外的施用模式，通常通過注射或輸注，包括但不限於靜脈內、肌肉內、動脈內、鞘內、囊內、眼眶內、心內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛網膜下、脊柱內、硬腦膜外和胸骨內注射和輸注。
本發明的血管發生抑制分子可以連同合適的賦形劑、載體或稀釋劑一起包含在藥物組合物中。
可用於本發明藥物組合物的合適的水性和非水性載體的實例包括水、乙醇、多元醇(諸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合適混合物、植物油(諸如橄欖油)和可注射有機酯(諸如油酸乙酯)。
這些組合物還可以包含諸如防腐劑、潤溼劑、乳化劑和分散劑等添加劑。通過滅菌過程和包含多種抗細菌和抗真菌劑可以確保預防微生物的存在，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等。還可能希望在組合物中包含等滲劑，諸如糖、氯化鈉等。另外，可以通過包含延遲吸收劑諸如單硬脂酸鋁和明膠來實現對可注射藥物形式的延長吸收。
在將本發明的化合物作為藥物施用於人和動物時，可以單獨給藥或是以包含例如0.01-99.5％(更優選0.1-90％)的活性成分連同藥物可接受載體的藥物組合物給藥。
無論選擇的給藥途徑，通過本領域技術人員已知的常規方法將可以以合適水合形式使用的本發明血管發生抑制分子和/或本發明的藥物組合物配製成製藥學可接受劑量形式。
本發明藥物組合物中活性成分的實際劑量水平可以變化以獲得對特定患者、組合物和給藥模式有效實現期望治療反應且對患者無毒的活性成分量。選擇的劑量水平將取決於多種藥動學因素，包括所採用的本發明特定組合物或其酯、鹽或醯胺的活性、給藥途徑、給藥時間、所採用的特定化合物的排洩速率、治療的持續時間、與所採用的特定組合物聯合使用的其它藥物、化合物和/或材料、接受治療的患者的年齡、性別、體重、狀況、一般健康和以前的病史、以及醫學領域眾所周知的類似因素。具有本領域普通技術水平的醫師或獸醫能夠容易地確定並開處所需藥物組合物的有效量。例如，醫師或獸醫可能由低於實現期望治療效果所需水平的藥物組合物中所採用的本發明化合物劑量開始並逐漸提高劑量直至實現期望效果。一般而言，本發明組合物的合適每日劑量將是產生治療效果的最低有效劑量的化合物的量。這種有效量通常將取決於上述因素。
合適的是，給藥可以是靜脈內、肌肉內、腹膜內或皮下，優選接近目標部位給藥。如果需要，可以在一天之中以合適間隔時間分開給藥兩個、三個、四個、五個、六個或更多亞劑量來施用治療組合物的有效每日劑量，任選採取單位劑量形式。儘管有可能單獨施用本發明的化合物，然而優選以藥物製劑(組合物)施用化合物。
例如，在使用H33作為血管發生抑制分子時，可以利用針對H33抗體的抗獨特型抗體或使用檢測H33抗體的其它特異方法(例如使用JAM-C進行包被的ELISA測定法)通過在施用後不同時間點測量生物學樣品中的循環H33抗體量來確定或調整劑量。
還可以使用本領域已知的醫學裝置來施用治療組合物。例如，在一個優選實施方案中，可以使用無針皮下注射裝置來施用本發明的治療組合物，諸如美國專利號5,399,163、5,383,851、5,312,335、5,064,413、4,941,880、4,790,824或4,596,556中公開的裝置。可用於本發明的眾所周知的植入物和組件(module)的實例包括美國專利號4,487,603，它公開了用於以受控速率分配藥物的可植入微型輸注泵；美國專利號4,486,194，它公開了用於穿過皮膚施用藥物的治療裝置；美國專利號4,447,233，它公開了用於以精確輸注速率投遞藥物的藥物輸注泵；美國專利號4,447,224，它公開了用於連續投遞藥物的變速流可植入輸注裝置；美國專利號4,439,196，它公開了具有多室隔室的滲透藥物投遞系統；以及美國專利號4,475,196，它公開了滲透藥物投遞系統。本領域技術人員知道許多這樣的其它植入物、投遞系統和組件。
在某些實施方案中，可以配製本發明的血管發生抑制分子以確保適當的體內分布。例如，血腦屏障(BBB)排斥許多高親水性化合物。為了確保本發明的治療化合物能夠穿過BBB(如果需要的話)，可以將它們配製成例如脂質體。關於製造脂質體的方法見例如美國專利號4,522,811、5,374,548和5,399,331。脂質體可以包含一種或多種部分，它們選擇性轉運進入特定細胞或器官，由此增強靶向藥物投遞(見例如V.V.Ranade，1989，J.Clin.Pharmacol.29685)。例示性靶向部分包括葉酸或生物素(見例如授予Low等的美國專利號5,416,016)、甘露糖苷(Umezawa等，1988，Biochem.Biophys.Res.Commun.1531038)、抗體(P.G.Bloeman等，1995，FEBS Lett.357140；M.Owais等，1995，Antimicrob.Agents Chemother.39180)、表面活性劑蛋白A受體(Briscoe等，1995，Am.J.Physiol.1233134，其不同種類可能構成本發明的製劑以及所發明分子的成分)、p120(Schreier等，1994，J.Biol.Chem.2699090)；還參見K.Keinanen、M.L.Laukkanen，1994，FEBS Lett.346123；J.J.Killion、I.J.Fidler，1994，Immunomethods 4273。
在本發明的一個實施方案中，將本發明的血管發生抑制分子配製成脂質體；在一個更優選的實施方案中，脂質體包含靶向部分。在一個最優選的實施方案中，通過接近期望部位(例如腫瘤部位)的快速推注來遞送脂質體中的治療化合物。組合物的流動性必須達到易於進行注射的程度。它在製造和貯藏條件下必須是穩定的，而且必須針對微生物(諸如細菌和真菌)的汙染作用進行防護。
本發明血管發生抑制分子的有效劑量和劑量方案取決於待治療的疾病或狀況，而且可以由本領域技術人員決定。
可以通過或是完全或是部分的客觀腫瘤反應來衡量用於治療腫瘤的「治療有效劑量」。完全反應(CR)定義為沒有疾病的臨床、放射學或其它跡象。部分反應(PR)源自總的腫瘤大小減小超過50％。中值進展時間是表徵客觀腫瘤反應持續時間的一種度量。
還可以通過它穩定疾病進展的能力來測定治療腫瘤的「治療有效劑量」。可以在預測在人腫瘤中的功效的動物模型系統中評估化合物抑制癌症的能力。治療化合物的治療有效量能夠縮小腫瘤大小，或者改善受試者中的症狀。本領域普通技術人員將能夠根據諸如受試者的體型、受試者症狀的嚴重程度和選擇的特定組合物或給藥途徑來決定這些量。
因此，用本發明組合物治療的患者可以額外施用(在施用本發明分子之前、同時或之後)另一種治療劑，它增強或提高本發明分子的治療效果。
此外，本發明還涉及本發明的化合物在診斷中的用途。例如，經標記抗體可用於在體內定位腫瘤。用放射性、順磁性或其它標記抗體是本領域眾所周知的技術。
在一個具體實施方案中，本發明提供了通過離體或在體外檢測樣品(例如組織樣品、體液樣品或細胞樣品)中的JAM-C來診斷JAM-C相關疾病的方法。這可以這樣來實現，例如在容許H33與JAM-C之間形成複合物的條件下使待測樣品(任選與對照樣品一起)接觸H33抗體或其衍生物或片段。然後可以檢測複合物的形成，例如使用ELISA。在與測試樣品一起使用對照樣品時，可以在這兩種樣品中檢測複合物，而且樣品之間複合物形成的任何統計學顯著差異指示測試樣品中存在JAM-C。
下面的實施例將進一步描述本發明。這些實施例只是出於例示目的，而非意圖以任何方式限制本發明。在實施例中涉及下列附圖。
圖1顯示了在人肝腫瘤中血管表達JAM-C。對一組血管發生性腫瘤分析JAM-C表達。正常肝中不存在編碼人JAM-C的轉錄本。用抗JAM-C抗體對冷凍切片的免疫染色顯示一個血管子群(箭頭)的表達。右圖顯示了針對PECAM-1的多克隆抗體的染色以顯現血管結構，而且以αvβ3染色(插圖)作為腫瘤血管發生特徵的對照。
圖2顯示了JAM-C在VEGF刺激後在HUVEC的內皮間接合處的募集。(A)將HUVEC用重組VEGF-165刺激，用甲醛固定，並用抗JAM-C單克隆抗體顯現JAM-C定位。進行JAM-A染色作為對照。JAM-C分子在VEGF-165刺激後在細胞-細胞接觸處富集，然而對JAM-A沒有看到作用。(B)FACS分析揭示了JAM-C在細胞-細胞接觸處的富集是由於該分子的重新定位，因為表達水平在VEGF處理後保持不變(細線，陰性對照；虛線，未處理細胞；粗線，VEGF處理細胞)。
圖3顯示了抗JAM-C單克隆抗體在體外消除血管發生。將來自小鼠的主動脈環在存在或缺乏抗JAM-C抗體(50μg/ml)的條件下在兩層Matrigel之間進行培養，並在12天後顯現新血管形成。圖片是代表性的未處理(A，n＝11)或用抗JAM-C單克隆抗體H33(B，n＝11)和D33(C，n＝6)或同種型匹配對照抗體Me114(D，n＝6)進行處理的主動脈環微血管的光學顯微照片。只有H33阻斷血管發生的萌發。
圖4顯示了抗JAM-C抗體H33降低腫瘤生長和腫瘤血管形成。給小鼠皮下注射LLC1腫瘤細胞，並隔天用抗JAM-C抗體或獨特型匹配對照抗體(150μg)進行處理。(A)在對照小鼠(PBS和同種型匹配對照抗體)或用H33抗JAM-C抗體處理的小鼠中生長的12日齡LLC1腫瘤的宏觀外觀。根據腫瘤體積(B)和腫瘤重量(C)的測量，用H 33抗JAM-C抗體處理的小鼠顯示腫瘤生長降低。通過PECAM-1免疫染色檢測微血管(D)並通過計算機分析進行定量(E)。*p＜0.01。每條柱代表十隻測試動物的平均值±sem。
圖5顯示了H33抗JAM-C抗體在體內沒有毒性。為了確保H33抗JAM-C抗體對腫瘤生長的作用不是由於一般體內毒性作用，如圖4中所述處理小鼠，並解剖和分析器官。(A)用Schiff氏高碘酸(PAS)染色的來自這些小鼠的腎沒有顯示腎小球腎炎發生的任何跡象。作為對照，用來自患自身免疫病NZBxBXSB小鼠的腎切片進行比較(Merino，R.等，J Clin Inyest.94(2)521-5，1994)。(B)使用伊文思藍(Evans blue)透性測定法評估體內血管透性。H33抗體在代表性器官心、肺、腎和腦中對血管透性沒有影響。每條柱代表七隻測試動物的平均值±sem。
圖6顯示了視網膜血管再形成過程中血管小球的定量。對血管小球的數目計數，並將H33處理和對照抗體處理小鼠中的視網膜新血管形成進行比較。與對照小鼠(ctrl)或用同種型匹配對照抗體(9B5)處理的小鼠相比，在H33處理小鼠(13H33)中觀察到血管小球數目減少。這指示H33處理動物的視網膜中新血管形成降低。
圖7顯示了抗JAM-C抗體H33降低了腫瘤中的巨噬細胞數目。將來自PBS、對照抗體或H33處理小鼠的LLC1腫瘤冷凍切片對酸性磷酸酶進行染色以檢測巨噬細胞(A，箭頭)。通過對腫瘤內每mm2被標記巨噬細胞數目進行計數來定量微血管密度(B)。與對照動物相比，來自H33處理動物的腫瘤顯示浸潤的巨噬細胞減少。每條柱代表由每組n只小鼠的四個切片獲得的平均值±SEM(PBS，n＝6；對照抗體，n＝6；H33，n＝9)。**p＜0.01。刻度尺，(A)160mm，(B)20mm。
圖8顯示了H33抗體既不影響內皮細胞的增殖，也不影響它的凋亡。每個孔以1.25×104至5×104個細胞的範圍接種內皮細胞(A)或LLC1腫瘤細胞(B)，並在存在或缺乏H33抗體或對照抗體的條件下進行培養。使用MTT測定法測定增殖速率。H33抗體不影響內皮和腫瘤細胞的增殖。(C)將來自同種型匹配對照或H33處理小鼠的LLC1腫瘤冷凍切片對PECAM-1進行免疫染色(綠色)，並對凋亡細胞進行TUNEL染色(紅色，箭頭)。在用H33抗體處理小鼠後，與對照相比，內皮細胞沒有顯示凋亡增加。相反，根據腫瘤內凋亡細胞的定量證明，腫瘤細胞顯示凋亡增加(D)。
實施例實施例1一組針對JAM-B或JAM-C的抗體的製備有待在本發明的方法中測試的一組抗體是依照Khler和Milstein，Nature 256495-497，1975製備的。用於獲得這組抗體的抗原的來源是如實施例2所述製備的重組可溶性JAM-B或JAM-C。
實施例2可溶性JAM-B和JAM-C的製備本發明人發現，JAM-C通過它的V結構域與JAM-B嗜異性(heterophilically)相互作用，而且可溶性JAM-C V結構域足以結合JAM-B。
使用相同的克隆策略通過PCR獲得可溶性JAM-B和可溶性JAM-C V結構域。引物是由Microsynth(Microsynth GmbH，Balgach，Switzerland)獲得的，用於克隆策略添加的限制位點標有下劃線。使用編碼鼠JAM-C全長序列的質粒、Pfu聚合酶、T7和(5′-gctctagacagtgttgccgtcttgcctacag-3′)作為正向和反向引物，擴增編碼JAM-C胞外V結構域的cDNA。用HindIII和XbaI消化PCR產物，然後克隆到含FLAG標籤序列的pcDNA 3中。
如下製備可溶性JAM-B使用(5′-tcagctaggcagccagct-3′)和(5′-gctctagaatctacttgcattcgcttcc-3′)作為正向和反向引物通過PCR獲得編碼可溶性JAM-B的cDNA。然後將用XbaI消化的PCR產物，使用EcoRI/平端和XbaI位點符合FLAG標籤序列讀框地克隆到pcDNA3中。
實施例3對防止JAM-B和JAM-C之間相互作用的能力的測試如Aurrand-Lions等，J Biol chem 2762733-41，2001a；Aurrand-Lions等，Blood 983699-707，2001b；以及Johnson-Leger等，Blood 1002479-2486，2002所述獲得在表面表達JAM-B或JAM-C的細胞。
用Alexa 488的磺基琥珀醯亞胺酯(Molecular Probes Inc.)或磺基-NHS-生物素(Pierce)依照製造商的流程標記如實施例2中所述獲得的可溶性JAM-B和JAM-C。
在存在待測試分子的條件下，分別使表達JAM-B或JAM-C的細胞接觸經標記的可溶性JAM-C或JAM-B。通過流式細胞術監測螢光，螢光強度相對於未處理對照的降低指示可溶性JAM-C或可溶性JAM-B的結合降低。
實施例4對在體內阻斷血管發生的能力的測試將出生後7天(P7)的小鼠置於75％氧氣中達五天，引起視網膜的中央驅血(central avascularization)(Reynolds等，NatureMedicine 827-34，2002)。在此培育後，將小鼠在含氧量正常的條件下再飼養五天(直至P17)。在P12、P14和P16給小鼠腹膜內注射50μg單克隆抗體。通過用不擴散的螢光素-葡聚糖溶液灌注整個血管系統來檢測新血管形成。在平整固定的視網膜中檢測到新血管形成和血管小球的區域。血管小球是應答血管發生性刺激而生成的且突入內界膜的高度增殖性彎曲血管叢。對血管小球的數目計數，對用待測試分子處理的小鼠和對照小鼠中的視網膜新血管形成進行比較。
測試的一種分子是引起新血管形成減少的單克隆抗體H33。
實施例5針對JAM-C的單克隆抗體H 33是血管發生和腫瘤生長的抑制物1.材料和方法抗體針對人和小鼠JAM-C的大鼠單克隆抗體(CRAM)(H33、H36和D33)和針對小鼠PECAM-1/CD31(GC51)和L選擇蛋白/CD62L(Me114)的大鼠單克隆抗體見先前的描述(Aurrand-Lions等，2001a，見上文；Gallatin等，Nature 33030-34，1983；Piali等，Eur J Immunol.232464-71，1993；Springer等，Eur.J.Immunol.9301，1979)。用作無關抗體對照大鼠IgG2a的抗人CD44(9B5)是由B.Engelhardt博士饋贈的(Laschinger和Engelhardt，2000)。任何其它無關抗體可用作陰性對照。針對人JAM-B的多克隆抗體是依照Palmeri等，JBiol Chem.27519139-45，2000製備的。單克隆小鼠抗人整聯蛋白αvβ3(LM609)購自Chemicon(Temecula，CA)。
內皮細胞通過臍靜脈的膠原酶處理分離人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)(WallRT等，J Cell Physiol 96203-213，1978)。在補充了20％胎牛血清(PAA Laboratories)、25mM HEPES(N-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸)、非必需胺基酸、丙酮酸鈉、內皮細胞生長補充物(ECGS，15μg/ml；Upstate Biotechnology，Lake Placid，NY)和肝素(4μg/ml；Sigma，Buchs，Switzerland)的M199中維持HUVEC。使用第3代和第5代之間的細胞。
VEGF刺激將1×105個HUVEC置於生長因子減少的Matrigel(BectonDickinson，Bedford，MA，USA)上。48小時後，將細胞與100ng/ml重組人VEGF-165(PeproTech House，London，UK)一起溫育15分鐘(免疫細胞化學)或15分鐘至24小時(流式細胞術)。
流式細胞術將HUVEC與H36抗JAM-C單克隆抗體一起在冰上溫育。用PBS、BSA 0.2％清洗後，使用偶聯了藻紅蛋白的抗大鼠抗體(JacksonImmunoresearch Laboratories公司，West Grove，PA，USA)檢測H36抗體的結合。省略一抗作為對照。使用FACSCalibur和Cellquest軟體(Becton Dickinson，Mountain View，CA，USA)進行分析。
免疫染色為了用單克隆抗體抗JAM-C(H 36)和針對JAM-B/VE-JAM的多克隆抗體進行免疫組織化學，將冷凍切片用1∶1的丙酮/甲醇於-20℃固定5分鐘，乾燥，並在PBS、0.2％明膠、0.05％吐溫20中再水合。為了進行免疫細胞化學，將細胞用4％低聚甲醛PBS固定15分鐘，然後用0.01％Triton X100的PBS透化10分鐘。用PBS、0.2％BSA清洗細胞，並與一抗一起溫育一小時，在清洗後再與偶聯了德州紅(TexasRed)、FITC或過氧化物酶的二抗(Jackson ImmunoresearchLaboratories公司，West Grove，PA，USA)一起溫育。使用共聚焦顯微鏡Zeiss LSM510獲取照片。通過Schiff氏高碘酸(PAS)對腎的染色檢測腎小球腎炎。
離體主動脈環測定法如Nicosia，R.F.和Ottinetti，In Vitro Cell Dev Biol.26(2)119-28，1990所述進行小鼠主動脈環測定法。簡而言之，將1mm胸主動脈環置於兩層任選含有待測試抗體的50μl生長因子減少的Matrigel(Becton Dickinson，Bedford，MA，USA)之間，並覆蓋100μl補充了20U/ml肝素(Sigma-Aldrich公司，Saint-Louis，MO，USA)和ECGS(Upstate biotechnology，Lake Placid，NY，USA)的DMEM。使用Zeiss Axioskop顯微鏡通過相差顯微鏡檢術顯現微血管的長出。
腫瘤移植給雌性8至10周齡C56BL6/J小鼠(Charles River laboratories，L′Arbresle，France)皮下接種1×106個鼠Lewis氏肺癌細胞(LLC1)。然後隔天給小鼠腹膜內注射150μg單克隆抗體H33、同種型匹配對照抗體Me114或PBS。當對照腫瘤(注射PBS的小鼠)達到1-1.5cm3時，處死動物，並切除和分析腫瘤。
血管定量如免疫染色一章中所述用單克隆抗PECAM-1抗體對腫瘤冷凍切片染色。使用Zeiss Axioskop顯微鏡獲取整個冷凍切片(每個腫瘤四個冷凍切片)的照片。使用Zeiss KS400軟體對PECAM-1染色和腫瘤總面積定量。
伊文思藍透性測定法將150μg抗JAM-C或同種型匹配對照抗體注射到經麻醉小鼠的眼眶後靜脈中。15分鐘後，以與抗體相同的方式注射100μl 30mg/kg伊文思藍染料(Sigma-Aldrich公司，Saint-Louis，MO，USA)的鹽水溶液，並循環一小時。然後給小鼠灌注檸檬酸鹽緩衝的1％低聚甲醛(pH4.2、37℃)，將染料清除出血管腔。灌注後立即解剖器官(腎、肺、心和腦)。將組織乾燥(Speed-Vac)後，測量乾重。隨後將組織在500μl甲醯胺中於70℃溫育18小時以提取伊文思藍。將提取液離心，並用分光光度計測量上清液在620nm處的吸光度。根據伊文思藍在甲醯胺中的標準曲線計算提取液中的染料濃度，並相對組織乾重進行標準化。
統計學分析使用Mann-Whitney氏t檢驗分析血管密度計數、腫瘤體積和腫瘤重量。使用統計學軟體StatView(Abacus Concepts公司，Berkeley，CA，USA)計算分析項。
結果JAM-C由腫瘤血管表達而且接受血管發鹽性刺激在人肝的血管發生性腫瘤中，抗JAM-C抗體H36將血管染色(圖1)。相反，正常肝中不存在編碼JAM-C的轉錄本。用VEGF處理HUVEC在15分鐘內導致JAM-C在內皮細胞-細胞接觸中的立即且大量積聚(圖2A)。這一短期表現是JAM-C重新定位的結果，而表達水平不受這種處理的改變(圖2B)。在用TNF-α或凝血酶刺激HUVEC後觀察到相同結果。
體外血管長出受到抗JAM-C單克隆抗體的抑制使用離體主動脈環測定法進行體外新血管形成。將新鮮解剖的小鼠主動脈切成小環，並包埋在含有或不含抗JAM-C抗體的Matrigel中。12天後評估由主動脈環長出的內皮血管。儘管對照抗JAM-C或同種型匹配抗體的存在不影響主動脈萌芽，然而H33抗JAM-C抗體完全阻斷新血管形成(圖3)。
抗JAM-C單克隆抗體在體內降低腫瘤生長和血管發生考慮到H33抗JAM-C抗體能夠阻斷體外血管發生，我們研究了該抗體是否影響腫瘤血管發生和腫瘤生長。給小鼠皮下注射Lewis氏肺癌細胞。然後隔天腹膜內注射抗JAM-C和對照抗體。當對照腫瘤達到1-1.5cm3時處死動物並切除腫瘤。與對照同種型匹配抗體或PBS相比，在用H33抗JAM-C抗體處理的小鼠中，腫瘤大小(圖4A)、體積(圖4B)和重量(圖4C)顯著降低。
切除腫瘤的代表性實例顯示於圖4A。Lewis氏肺癌細胞不表達JAM-C(未顯示的數據)。H33抗體對腫瘤生長的作用是由於對血管發生的抑制。為了顯現腫瘤的血管系統，用針對內皮標誌物PECAM-1的抗體將冷凍切片免疫染色(圖4D)。通過對腫瘤區域的PECAM-1染色百分率計數而對血管密度定量(圖4E)。與對照相比，H33抗體降低了腫瘤中的血管數目。
H33抗JAM-C單克隆抗體在體內沒有毒性已知體內注射抗體可能是有毒的。為了檢驗所觀察到的H 33抗JAM-C抗體的作用不是由於在小鼠中的一般毒性作用，研究了注射了抗體的動物是否發展病理學情況。因為JAM-C由腎的內皮表達，所以首先分析抗體是否產生腎小球腎炎。為此，將經處理的小鼠的腎切片用Schiff氏高碘酸染色。沒有檢測到蛋白質在腎小球中的異常積聚(圖5A)。
由於JAM-C參與控制血管透性，還檢驗了抗體是否誘導血管滲漏。幸運的是，在所分析的代表性器官心、肺、腎或腦中並非如此(圖5B)。
與對照小鼠(ctrl)或用同種型匹配對照抗體處理的小鼠相比，在用H33處理的小鼠的視網膜中觀察到血管小球的數目減少。這指示在H33處理動物的視網膜中新血管形成降低(圖6)。
實施例6抗JAM-C抗體H33減少腫瘤中的巨噬細胞數目但既不影響內皮細胞的增殖也不影響它的凋亡材料和方法腫瘤中血管密度、凋亡細胞和巨噬細胞含量的組織學和定量為了用單克隆抗體抗PECAM-1(GC51)對腫瘤冷凍切片進行免疫組織化學，將切片用1∶1的丙酮/甲醇於-20℃固定5分鐘，乾燥，並在PBS/0.2％明膠/0.05％吐溫20中水合。將切片與抗體一起於室溫溫育1小時，在PBS中清洗3次，與偶聯了過氧化物酶的二抗(JacksonImmunoresearch Laboratories公司，West Grove，PA，USA)一起溫育。
為了用針對PECAM-1和JAM-C的多克隆抗體對低聚甲醛固定且石蠟包埋的眼切片進行免疫組織化學，依照經典流程將切片脫蠟。然後將組織切片用0.3％H2O2的甲醇溶液處理10分鐘，在PBS中清洗，並用PBS/3％BSA/0.1％吐溫20封閉30分鐘。將切片與多克隆抗體一起於室溫溫育1小時，並在PBS中清洗後，與EnVisionTM系統(DakoCytomation AG，Zg，Switzerland)一起溫育30分鐘。
使用先前描述的方法(Kindler，V.等，Cell，56731-740，1989)對腫瘤冷凍切片檢測酸性磷酸酶活性。對腫瘤冷凍切片檢測凋亡細胞是基於對DNA鏈斷裂的標記(TUNEL螢光法)，並使用末端轉移酶和生物素-16-dUTP依照製造商(Roche diagnostics AG，Rotkreuz，Switzerland)的指示進行的。
用偶聯了德州紅染料的鏈黴親和素(Jackson ImmunoresearchLaboratories公司，West Grove，PA，USA)檢測結合的生物素-16-dUTP。
使用配備了Axiocam彩色CCD相機的Zeiss LSM510共聚焦顯微鏡或Zeiss Axiophot 1顯微鏡獲取照片。記錄圖像，並使用AxioVisionTM軟體(Zeiss，Oberkochen，Germany)進行處理。
為了對腫瘤中酸性磷酸酶陽性細胞(巨噬細胞)的數目和TUNEL陽性細胞(凋亡細胞)的數目定量，使用Zeiss KS400或Openlab軟體(Zeiss，Oberkochen，Germany)分析整個冷凍切片(每個腫瘤4個冷凍切片)的照片。
用於測定細胞增殖的MTT測定法使用如Hansen，MB等，J Immunol Methods 119203-210，1989中所述的MTT(3，(4，5-二甲基噻唑-2-基)2，5-二苯基-四唑溴化物)法測定鼠原代內皮細胞(LMEC)和腫瘤細胞(LLC1)的增殖指數。簡而言之，以1.25×104至1×105個細胞/孔的密度一式三份將細胞置於96孔板中，並在含有或不含50mg/ml抗JAM-C抗體H33或對照抗體9B5的完全培養基中進行培養。培養24小時後，向每個孔中加入25ml MTT溶液(5mg/ml，溶於無菌PBS)，並於37℃溫育2小時後，加入100ml萃取緩衝液(20％w/v SDS，溶於DMF和脫礦質水的溶液；通過添加2.5％的80％乙酸和2.5％的1N HCl將pH調至4.7)。於37℃溫育過夜後，使用微量滴定板讀板儀(Molecular devices公司，CA，USA)測量570nm處的光密度。
結果H33抗JAM-C抗體降低巨噬細胞進入腫瘤的募集腫瘤血管發生常常伴隨著炎症，而巨噬細胞代表主要的腫瘤相關炎症細胞(Crowther，M等，J Leukoc Biol 70478-490，2001)。事實上，巨噬細胞通過分泌血管生成因子諸如VEGF而參與血管發生，主要在含氧量低的條件下(Murdoch，C等，Blood 104(8)2224-34，2004)。JAM-C參與白細胞粘附和遷移通過內皮和上皮細胞(Zen，K等，Mol Biol Cell 153926-3937，2004；Chavakis，T等，J BiolChem，2004；Johnson-Leger，CA等，Blood 1002479-2486，2002；Cunningham，SA等，J Biol Chem 27534750-34756，2000)。
因此研究了H33抗體是否影響巨噬細胞進入腫瘤的募集。如圖7B和7D所示，與對照小鼠相比，用H33抗體處理的小鼠顯示腫瘤中的巨噬細胞含量降低。這指示H33對血管發生的作用是部分由其對巨噬細胞募集的作用介導的。
H33抗JAM-C抗體不影響內皮細胞增殖或凋亡血管發生是一個複雜的過程，伴隨著內皮細胞在血管發生性刺激後的增殖和結構重組。首先測試了H33抗體是否在體外通過抑制內皮細胞增殖而阻斷血管發生，發現沒有作用(圖8A)。為了避免H 33處理對腫瘤細胞增殖的任何直接後果，還在體外用腫瘤細胞進行了實驗，沒有檢測到任何作用(圖8B)。
這些結果指示施用H33後觀察到的血管發生降低不是由對血管或腫瘤細胞生長的防止引起的。對凋亡的刺激將是H33處理誘導血管發生降低的另一種解釋。通過凋亡細胞的標準標記方案(TUNEL)鑑定凋亡，由此對腫瘤切片檢驗了這種假設。結果揭示了H33抗體在體內和在體外對內皮細胞凋亡沒有效果(圖8C和未顯示的數據)。然而，腫瘤細胞顯示體內TUNEL標記增加，說明由於抗體介導血管形成降低而發生了凋亡(圖8C和D)。
權利要求
1.用作藥物的血管發生抑制分子，其選自由雜交瘤13H33生成的抗體H33及其片段和衍生物，所述雜交瘤13H33於2003年10月22日保藏於Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH，保藏編號DSM ACC2622。
2.權利要求1的血管發生抑制分子，用於癌症治療或診斷。
3.權利要求2的血管發生抑制分子，用於實體瘤治療或診斷。
4.權利要求1-3任一項中的血管發生抑制分子，其中所述分子是選自下組的H33片段Fab片段、Fv片段、單個結構域抗原結合片段、scFv及其聚集體、VHHs。
5.權利要求1-3任一項中的血管發生抑制分子，其中所述抗體H33衍生物是與H33具有相同特異性的人單克隆抗體。
6.權利要求5的血管發生抑制分子，其中所述人單克隆抗體是在轉基因小鼠中生成的。
7.權利要求1-3任一項中的血管發生抑制分子，其中所述分子是選自下組的衍生物與抗體H33具有相同特異性的重組抗體、基於抗體H33的人源化抗體和基於抗體H33的嵌合抗體。
8.權利要求1-7任一項中的血管發生抑制分子用於製備治療癌症的治療或診斷組合物的用途。
9.權利要求1-7任一項中的血管發生抑制分子用於製備治療實體瘤的治療或診斷組合物的用途。
10.用於治療癌症特別是治療實體瘤的治療組合物，包含治療有效量的一種或多種權利要求1-7任一項中的血管發生抑制分子以及賦形劑、載體或稀釋劑。
11.用於診斷癌症特別是診斷實體瘤的診斷組合物，包含診斷有效量的一種或多種權利要求1-7任一項中的血管發生抑制分子以及賦形劑、載體或稀釋劑。
12.由雜交瘤13H33生成的抗體H33用於製備實體瘤治療或診斷的藥物組合物的用途，所述雜交瘤13H33於2003年10月22日保藏於Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，保藏編號DSM ACC2622。
13.用於治療癌症特別是治療實體瘤的治療組合物，包含治療有效量的由雜交瘤13H33生成的抗體H33以及賦形劑、載體、或稀釋劑，所述雜交瘤13H33於2003年10月22日保藏於Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH，保藏編號DSM ACC2622。
14.用於診斷癌症特別是檢測人或動物體中的實體瘤的診斷組合物，包含診斷有效量的由雜交瘤13H33生成的抗體H33、其片段或衍生物以及賦形劑、載體或稀釋劑，所述雜交瘤13H33於2003年10月22日保藏於Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH，保藏編號DSM ACC2622。
15.由雜交瘤13H33生成的抗體H33的片段，所述雜交瘤13H33於2003年10月22日保藏於Deutsche Sammlung von Mikroorganismenund Zellkulturen GmbH，保藏編號DSM ACC2622，所述片段具有H33的特異性。
16.權利要求15的片段，其選自Fab片段、Fv片段、單個結構域抗原結合片段、scFv及其聚集體、VHHs。
17.由雜交瘤13H33生成的抗體H33的衍生物，所述雜交瘤13H33於2003年10月22日保藏於Deutsche Sammlung von Mikroorganismenund Zellkulturen GmbH，保藏編號DSM ACC2622，所述衍生物具有H33的特異性。
18.權利要求17的衍生物，其為與H33具有相同特異性的人單克隆抗體。
19.權利要求18的衍生物，其中所述人單克隆抗體是由轉基因小鼠生成的。
20.權利要求17的衍生物，其選自與抗體H33具有相同特異性的重組抗體、基於抗體H33的人源化抗體和基於抗體H33的嵌合抗體。
21.權利要求15-20任一項中的單克隆抗體H33的片段或衍生物，用作藥物。
22.權利要求15-20任一項中的單克隆抗體H33的片段或衍生物，用作於癌症治療或診斷。
23.權利要求15-20任一項中的單克隆抗體H33的片段或衍生物，用於實體瘤治療或診斷。
24.權利要求15-20任一項中的抗體H33的片段或衍生物用於製備用於癌症治療或診斷的藥物組合物的用途。
25.權利要求15-20任一項中的抗體H33的片段或衍生物用於製備用於實體瘤治療或診斷的藥物組合物的用途。
全文摘要
本發明涉及血管發生抑制分子，即單克隆抗體H33或其片段或衍生物，它們在癌症治療特別是實體瘤治療中的用途、以及包含它們的治療和診斷組合物。本發明具體涉及H33人源化衍生物或具有H33特異性的人單克隆抗體。
文檔編號G01N33/574GK1890567SQ200480034030
公開日2007年1月3日 申請日期2004年11月19日 優先權日2003年11月19日
發明者B·A·伊姆霍夫, M·奧蘭德-萊恩斯 申請人:西洛諾實驗室公司