玫瑰紅鵝膏發酵菌絲體中肽類毒素的發現的製作方法
2023-10-09 08:22:09 2
專利名稱：玫瑰紅鵝膏發酵菌絲體中肽類毒素的發現的製作方法
技術領域：
本發明研究了玫瑰紅鵝膏發酵菌絲體中的肽類毒素，並提供發酵製備方法及條件，研究表明玫瑰紅鵝膏菌絲體含有α-鵝膏毒肽和β-鵝膏毒肽。該研究為毒素獲得提供新的資源。
背景技術：
鵝膏菌是一個世界性分布的大屬，有毒蘑菇中最重要的一類，目前已定名的約有500多種。該屬屬於擔子菌亞門(Basidiomycotina)、層菌綱(Hymenomycetes)、傘菌目(Agaricales)、鵝膏科(Amanitaceae)、鵝膏屬(Amanita Pers. :Gray) 鵝膏菌中主要的毒素為肽類毒素，共有3大類22種，分別為鵝膏毒肽(amatoxins) 9種、鬼筆毒肽(phallotoxins) 7種和毒傘素(virotoxins) 6種。肽類毒素由於獨特的生物學特性，目前 廣泛應用於生物學、醫學、遺傳學、生物化學、基因工程，病毒等研究領域，人們希望能通過對其毒性成分和藥理學研究找到一種理想的藥物，使其成為治病的良藥，這也是當前擺在藥物學和菌物學工作者面前的一項重要的研究課題。在生物學方面，鵝膏毒素作為研究分子生物學的一種工具。由於鵝膏屬絕大多數種是外生菌根真菌，很難人工培養，毒素基本來源於野外採集的子實體。毒素來源美國Sigma公司每毫克價格在12 14萬美元。由於鵝膏屬在真菌中的關鍵性地位以及其毒素的特殊性，因此人工培養鵝膏菌的努力從來沒有停止過。
發明內容
本發明採用了常規已知的方法製備玫瑰紅鵝膏發酵菌絲體，具體如下(I)最適培養基(改良PDM):馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，磷酸二氫鉀3g/L，硫酸鎂0. 5g/L，磷酸氫氨0. 5g/L，氯化鈣0. 05g/L,硝酸鉀0. I g/L,麥芽汁(12波美度)120ml，維生素 B10. 01g/L。(2)菌種培養斜面菌種於26°C恆溫培養箱培養IOd後，將適量菌絲接入最適培養基中，然後置於恆溫振蕩器上，150r/min振蕩培養10d。搖瓶發酵250mL三角瓶裝IOOmL培養液，接種量5% (v/v),置於26°C恆溫振蕩器上，150r/min振蕩培養25d。本發明採用了常規已知的方法檢測玫瑰紅鵝膏發酵菌絲體中的肽類毒素，方法和結果如下I.實驗方法(I)粗毒液的製備菌種培養完成後，將發酵液過濾，收集濾渣和濾液，把菌絲體在60°C下烘乾後研磨。取Ig研磨後的菌絲體粉末，溶於IOml 50%甲醇中，室溫下振蕩抽提24h，8000r/min離心收集上清液。沉澱以IOml 50%甲醇室溫下振蕩抽提24h 8000r/min離心收集並合併上清液。用石油醚去脂兩次，然後冷凍乾燥，凍幹的樣品用超純水溶解，再用
0.22um的微孔濾膜過濾，得到鵝膏粗毒液。
(2)毒素的分離純化HPLC測定參數使用安捷倫1100高效液相色譜儀分離梯度模式為0 — 15min, B O — 5%, A 100% — 95% ；15 — 35min, B 5 — 80%, A 95% — 20% ；35 — 40min, B 80%, A 20% ；40-45min, B 80 — 100%, A 20 — 0% ；45-50min, B 100% ；50 — 55min, B 100 — 0%, AO— 100%並保持IOmin ;純化梯度模式與分離梯度模式相同。檢測波長295nm ;柱溫40°C;流速分析柱lmL/min ;半製備柱2mL/min。進樣量分析柱10 μ L,半製備柱lmL。HPLC分析先在半製備柱上進行毒素的分離和純化，得到5種化合物，冷凍乾燥後，用HPLC分離純化再用液相色譜質譜聯用儀進行鑑定。2.實驗結果液相保留時間，因不同的分離條件和不同的色譜柱，保留時間有一定的差異，但是各個化合物在液相上的出峰順序保持不變。同時根據液相色譜質譜聯用儀和內標法確定化 合物。化合物I在分析柱上檢測結果(如說明書附
圖1，圖I化合物I的HPLC圖譜圖)所示，檢測化合物I保留時間是11. 41min，純度較高。電噴霧質譜[M+Na]峰是941，MW是918(如說明書附圖2，圖2化合物I的電噴物圖譜圖)，。根據色譜保留時間和分子量，判斷組分為α -鵝膏毒肽(α -ΑΜΑ)，分子式為C39H54N10O14So化合物2在分析住上檢測結果(如說明書附圖3，圖3化合物2的HPLC圖譜圖)所示，檢測化合物2保留時間是7.92min。電噴霧質譜[M_H]峰是918，麗是919 (如說明書附圖4，圖4化合物2的電噴物圖譜圖)。根據色譜保留時間和分子量，判斷組分為β_鵝膏毒肽(β -ΑΜΑ)，分子式 C39H53N9O15S15此外，還分離純化了三種未知的肽類毒素。
權利要求
1.肽類毒素由於獨特的生物學特性，目前廣泛應用於生物學、醫學、遺傳學、生物化學、基因工程，病毒等研究領域。該研究為毒素獲得提供新的資源。
2.由權利要求I的製備得到玫瑰紅鵝膏的發酵菌絲體含有α-鵝膏毒肽(α -ΑΜΑ)和β -鵝膏毒肽(β -ΑΜΑ)及其他未知毒素。
全文摘要
本發明研究了玫瑰紅鵝膏發酵菌絲體中的肽類毒素，並提供發酵製備方法及條件，研究表明玫瑰紅鵝膏菌絲體含有α-鵝膏毒肽和β-鵝膏毒肽。該研究為毒素獲得提供新的資源。
文檔編號C07K14/37GK102786586SQ20121025178
公開日2012年11月21日 申請日期2012年7月20日 優先權日2012年7月20日
發明者包海鷹, 張楠 申請人:包海鷹