人源化抗人CTLA4單克隆抗體及其製備方法和用途與流程

2024-04-15 23:03:05

人源化抗人ctla4單克隆抗體及其製備方法和用途
技術領域
1.本發明屬於腫瘤免疫療法和分子免疫學領域，尤其是涉及一種人源化抗人ctla4單克隆抗體。本發明還涉及該人源化抗人ctla4單克隆抗體的製備方法及其的用途。


背景技術：

2.脊椎動物的免疫系統是一個由多種器官、組織、細胞和分子組成的功能性系統，是機體防衛外源物入侵的最有效的機制(janeway et al.,immunology:the immune system in health and disease.new york:garland science,2005)。免疫器官、組織、細胞間相互協作、制衡，在眾多免疫檢查點蛋白和細胞因子的協調下，達到保護機體免受外來侵染和維持體內平衡的作用。針對外來病原體的獲得性免疫系統由體液免疫(由b細胞介導)和細胞免疫(由t細胞介導)組成。其中，細胞免疫是通過t細胞受體(tcr)識別抗原呈遞細胞(apc)上主要組織相容性複合體(mhc)呈遞的抗原來引起的。這種激活還需要apc的共刺激。apc上的兩種同源b7家族成員b7-1(也稱為b7、b7.1或cd80)和b7-2(也稱為b7.2或cd86)，都可在與t細胞上cd28抗原結合時遞送共刺激信號，導致t細胞激活。ctla4和cd28同是含有單個細胞外ig結構域的ig超家族的成員，均可結合b7蛋白，但調控效果相反。ctla4比cd28與b7蛋白的結合有更高的親和力，競爭形成更穩定相互作用，使t細胞缺乏第二級刺激信號，變得無能(anergic)；同時可以在t細胞激活後，誘導t細胞凋亡。從而對免疫系統進行負調節，維持體內t細胞穩態。因此，用單克隆抗體阻斷ctla4傳導的負調節信號可以提供受益於免疫刺激的人類疾病的新療法，比如癌症和傳染性疾病的免疫治療。目前ctla4單克隆抗體已在不同的臨床試驗階段用於治療多種人類癌症，包括黑色素瘤、前列腺癌、膀胱癌、結腸直腸癌、惡性間皮瘤、胃腸道癌、肝癌、非小細胞肺癌(grosso et al.,cancer immunology 13:5,2013)。現已有ipilimumab(keler et al.,j immunol171:6251-6259(2003))和tremelimumab(ribas et al.,oncologist12:873-883(2005))。目前已經成功上市的一種ctla4單克隆抗體，ipilimumab(商品名yervoy)標誌著腫瘤免疫療法在臨床階段切實可行。而且，隨著臨床前實驗驗證了針對不同免疫調節因子的單克隆抗體在協同治療癌症方面的能力，ctla4單克隆抗體已與不同免疫抑制分子的單克隆抗體或者小分子化合物形成組合療法，正在針對不同癌症進行臨床實驗。但目前上市的只有一種ctla4單克隆抗體，而且ctla4單克隆抗體也存在不同程度的副反應，包括可在某些患者中誘導免疫原性，過度抑制ctla4信號可能引起自身免疫病，以及不同ctla4單克隆抗體具有不同程度的可開發性。同時，為避免不同患者人群療效差異，開發新的具有更高的親和力、特異性、功能性以及多樣性的能夠阻斷ctla4與b7蛋白結合的人源化功能性抗體，成為腫瘤免疫治療的亟待解決的課題。


技術實現要素：

3.在一方面，本發明提供了人源化抗人ctla4單克隆抗體或其功能片段，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區包含分別與如下hcdr1、hcdr2和hcdr3序列具有至少
80％同一性的胺基酸序列，所述輕鏈可變區包含分別與如下lcdr1、lcdr2和lcdr3序列具有至少80％同一性的胺基酸序列：
4.hcdr1的胺基酸序列為sywin；
5.hcdr2的胺基酸序列為riapgsgttyynemftg；
6.hcdr3的胺基酸序列為gdyfdy；
7.lcdr1的胺基酸序列為sasksvsyih；
8.lcdr2的胺基酸序列為dtstlas；
9.lcdr3的胺基酸序列為qqrttyplt。
10.在一個實施方案中，所述重鏈可變區包含分別與上述hcdr1、hcdr2和hcdr3序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的胺基酸序列。
11.在一個實施方案中，所述輕鏈可變區包含分別與如下lcdr1、lcdr2和lcdr3序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的胺基酸序列。
12.在一個實施方案中，本發明提供了人源化抗人ctla4單克隆抗體或其功能片段，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區包含如下hcdr1、hcdr2和hcdr3序列所示的胺基酸序列，所述輕鏈可變區包含如下lcdr1、lcdr2和lcdr3序列所示的胺基酸序列：
13.hcdr1的胺基酸序列為sywin；
14.hcdr2的胺基酸序列為riapgsgttyynemftg；
15.hcdr3的胺基酸序列為gdyfdy；
16.lcdr1的胺基酸序列為sasksvsyih；
17.lcdr2的胺基酸序列為dtstlas；
18.lcdr3的胺基酸序列為qqrttyplt。
19.本發明提供了人源化抗人ctla4單克隆抗體或其功能片段，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區包含分別在如下hcdr1、hcdr2和hcdr3序列中替換、插入或缺失1個、2個或3個胺基酸殘基的胺基酸序列，所述輕鏈可變區包含分別在如下lcdr1、lcdr2和lcdr3序列中替換、插入或缺失1個、2個或3個胺基酸殘基的胺基酸序列：
20.hcdr1的胺基酸序列為sywin；
21.hcdr2的胺基酸序列為riapgsgttyynemftg；
22.hcdr3的胺基酸序列為gdyfdy；
23.lcdr1的胺基酸序列為sasksvsyih；
24.lcdr2的胺基酸序列為dtstlas；
25.lcdr3的胺基酸序列為qqrttyplt。
26.在一個實施方案中，所述重鏈可變區胺基酸序列選自：seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15或seq id no:16。
27.在一個實施方案中，所述輕鏈可變區胺基酸序列選自：seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23或seq id no:24。
28.在一個實施方案中，其中，
29.所述重鏈可變區為seq id no:9以及所述輕鏈可變區為seq id no:17；
30.所述重鏈可變區為seq id no:10以及所述輕鏈可變區為seq id no:18；
31.所述重鏈可變區為seq id no:11以及所述輕鏈可變區為seq id no:19；
32.所述重鏈可變區為seq id no:12以及所述輕鏈可變區為seq id no:20；
33.所述重鏈可變區為seq id no:13以及所述輕鏈可變區為seq id no:21；
34.所述重鏈可變區為seq id no:14以及所述輕鏈可變區為seq id no:22；
35.所述重鏈可變區為seq id no:15以及所述輕鏈可變區為seq id no:23；或
36.所述重鏈可變區為seq id no:16以及所述輕鏈可變區為seq id no:24。
37.在一個實施方案中，其中，
38.所述重鏈可變區為seq id no:10以及所述輕鏈可變區為seq id no:18；
39.所述重鏈可變區為seq id no:11以及所述輕鏈可變區為seq id no:19；
40.所述重鏈可變區為seq id no:12以及所述輕鏈可變區為seq id no:20；或
41.所述重鏈可變區為seq id no:14以及所述輕鏈可變區為seq id no:22。
42.在一個實施方案中，其中，
43.所述重鏈可變區為seq id no:11以及所述輕鏈可變區為seq id no:19；或
44.所述重鏈可變區為seq id no:14以及所述輕鏈可變區為seq id no:22。
45.在一個實施方案中，本發明的人源化抗人ctla4單克隆抗體或其功能片段，其包含重鏈具有如seq id no:1所示的胺基酸序列，和輕鏈具有如seq id no:2所示的胺基酸序列。
46.在一個實施方案中，本發明的人源化抗人ctla4單克隆抗體或其功能片段與clta4之間的解離常數kd小於0.02nm。
47.在一個實施方案中，本發明的人源化抗人ctla4單克隆抗體或其功能片段特異性地解除ctla4的免疫負調節，激活t細胞分泌細胞因子。
48.在另一方面，本發明提供了分離的多核苷酸，其編碼所述人源化抗人ctla4單克隆抗體或其功能片段。
49.在一個實施方案中，本發明的多核苷酸包含編碼所述人源化抗人ctla4單克隆抗體的重鏈可變區的重鏈編碼序列，和編碼所述人源化抗人ctla4單克隆抗體的輕鏈可變區的輕鏈編碼序列。
50.在另一方面，本發明提供了表達載體，其包含所述多核苷酸。
51.在另一方面，本發明提供了宿主細胞，其包含所述表達載體。
52.在一個實施方案中，所述宿主細胞為hek293-6e細胞。
53.在另一方面，本發明提供所述人源化抗人ctla4單克隆抗體或其功能片段、所述多核苷酸、所述表達載體或所述宿主細胞在製備用於抗腫瘤的藥物中的用途。
54.在另一方面，本發明提供了所述人源化抗人ctla4單克隆抗體或其功能片段、所述多核苷酸、所述表達載體或所述宿主細胞用於治療腫瘤的用途。
55.在一個實施方案中，所述腫瘤選自多發性骨髓瘤、非小細胞肺癌、結腸直腸癌、腎細胞癌、前列腺癌、乳腺癌和卵巢癌。
56.在另一方面，本發明提供了所述人源化抗人ctla4單克隆抗體或其功能片段、所述多核苷酸、所述表達載體或所述宿主細胞用於治療腫瘤。
57.在一個實施方案中，所述腫瘤選自多發性骨髓瘤、非小細胞肺癌、結腸直腸癌、腎
細胞癌、前列腺癌、乳腺癌和卵巢癌。
58.在另一方面，本發明提供了抗腫瘤藥物組合物，其包含有效量的所述人源化抗人ctla4單克隆抗體或其功能片段，和藥學上可接受的載體。
59.在另一方面，本發明提供了製備所述人源化抗人ctla4單克隆抗體或其功能片段的方法，包括以如所述表達載體轉染感受態細胞，並對所述細胞進行培養。
60.在另一方面，本發明提供了一種製備所述人源化抗人ctla4單克隆抗體或其功能片段的方法，包括：
61.(1)對鼠源抗體進行人源化，獲得所述人源化抗人ctla4單克隆抗體或其功能片段的輕鏈和重鏈的可變區編碼序列；以及
62.(2)用所述可變區編碼序列進行重組抗體生產，獲得功能性所述人源化抗人ctla4單克隆抗體或其功能片段。
63.本發明提供的人源化抗人ctla4單克隆抗體對ctla4具有高親和性、高特異性，能夠刺激t細胞分泌細胞因子，例如特異地解除ctla4的免疫負調節，激活t細胞分泌細胞因子。因而，本發明提供的功能性人源化抗人ctla4單克隆抗體，可通過阻斷ctla4信號通路來激活t細胞，進而實現腫瘤免疫治療的目的。
64.附圖簡要說明
65.圖1.人源化抗人ctla4單克隆抗體親和力測定；
66.圖2.純化單克隆抗體能夠解除ctla4的免疫負調節；
67.圖3.純化單克隆抗體熱穩定性分析，具體為人源化抗人ctla4單克隆抗體熱穩定性sec-hplc分析(40℃處理2周)：嵌合抗體-14天-sec-hplc(圖3a)、ah01674-14天-sec-hplc(圖3b)和ah01695-14天-sec-hplc(圖3c)；
68.圖4.純化單克隆抗體熱穩定性分析，具體為人源化抗人ctla4單克隆抗體熱穩定性elisa分析(40℃處理2周)：嵌合抗體(在本文以及附圖中也可稱為「嵌合igg」，二者可互換使用)(圖4a)、ah01674(圖4b)和ah01695(圖4c)；
69.圖5.純化單克隆抗體熱穩定性分析，具體為人源化抗人ctla4單克隆抗體熱穩定性elisa分析(溫度梯度)：ah01674(圖5a)和ah01695(圖5b)；
70.圖6.純化單克隆抗體成藥性檢測分析，具體為人源化抗人ctla4單克隆抗體氧化加壓試驗後親和力檢測：嵌合抗體(圖6a)、嵌合抗體-aaph(圖6b)、ah01674(圖6c)、ah01674-aaph(圖6d)、ah01695(圖6e)和ah01695-aaph(圖6f)；
71.圖7.純化單克隆抗體成藥性檢測分析，具體為人源化抗人ctla4單克隆抗體氧化加壓試驗後sec檢測：嵌合抗體(圖7a)、嵌合抗體-aaph(圖7b)、ah01674(圖7c)、ah01674-aaph(圖7d)、ah01695(圖7e)和ah01695-aaph(圖7f)。
具體實施方式
72.除非另有說明，本發明所用的技術和科學術語具有與本發明所屬領域的普通技術員通常所理解的含義。
73.本文所用的術語「抗體」指免疫球蛋白分子，其通常為由2個相同重鏈和2個相同輕鏈通過二硫鍵相互連接組成的四聚體。根據胺基酸序列的保守性差異，將重鏈和輕鏈分為位於氨基端的可變區(v)和位於羧基端的恆定區(c)。在重鏈和輕鏈的可變區內，分別有三
個局部區域的胺基酸組成和排列順序具有更高的變異程度，為抗體與抗原結合的關鍵位置，因而也稱為互補決定區(cdr)。在本文中，三個重鏈互補決定區分別稱為hcdr1、hcdr2和hcdr3，三個輕鏈互補決定區分別稱為lcdr1、lcdr2和lcdr3。一條重鏈和一條輕鏈的可變區相互作用形成了抗原結合部位(fv)。根據它們重鏈恆定區的胺基酸序列，可將抗體分為不同類別。有五種主要類型的完整抗體：iga、igd、ige、igg和igm，並且這些中的一些可進一步分為亞類，例如，igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2。不同類別的免疫球蛋白的亞單位結構和三維構象在本領域內是已知的。本發明旨在包括任何前述類或亞類的抗體。
74.本文使用的術語「抗體」還旨在涵蓋其消化片段或功能性變體，例如，能夠結合ctla4或其部分的抗體片段，包括但不限於fab(例如，抗體經木瓜蛋白酶消化而得到)、f(ab』)2(例如，通過胃蛋白酶消化得到)、fv或scfv(例如通過分子生物學技術得到)。
75.本文使用的術語「單克隆抗體」指均一的僅針對某一特定抗原表位的抗體。與典型地包括針對不同抗原決定簇(表位)的不同抗體的普通多克隆抗體製劑相比，每種單克隆抗體針對抗原上的單個抗原決定簇。修飾語「單克隆」表示抗體的均一特徵，不解釋為需要通過任何特定方法產生的抗體。本發明的單克隆抗體優選通過重組dna方法產生，或通過本文其它地方描述的篩選方法獲得。
76.本文使用的術語「分離的多核苷酸」指非自然界中天然存在狀態的多核苷酸，包括通過生物學技術從自然界(包括生物體內)分離出的多核苷酸，也包括人工合成的多核苷酸。分離的多核苷酸可以是基因組dna、cdna、mrna或合成的其它rna，或者它們的組合。本文提供了多個用於編碼人源化抗ctla4單克隆抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區的核苷酸序列，需要指出的是，本領域技術人員可以根據本文所提供的重鏈可變區和輕鏈可變區的胺基酸序列，基於密碼子簡併性，設計出與以上提供的核苷酸序列不完全相同的核苷酸序列，但都編碼相同的胺基酸序列。這些經改動的核苷酸序列也包括在本發明的範圍內。
77.本文中所用的胺基酸殘基/位置「修飾」，指相對於初始胺基酸序列的一級胺基酸序列變化，其中變化來自於涉及所述胺基酸殘基/位置的序列的改變。例如，典型的修飾包括用另一個胺基酸替換(如，保守或非保守替換)(在所述位置上的)殘基、在所述殘基/位置相鄰位上插入一個或多個(一般少於5或3個)胺基酸、和缺失所述殘基/位置。「胺基酸替換」、或其變化，指在預先確定的(初始)胺基酸序列中，用不同的胺基酸殘基代替現有的胺基酸殘基。相對於含初始(或「野生型」)胺基酸序列的多肽，修飾一般優選會產生變體多肽的至少一種生理生化活性的改變。例如，對於抗體，改變的生理生化活性可以是針對靶分子的結合親和力、結合能力和/或結合效果。
78.關於肽或多肽序列的「百分比(％)胺基酸序列同一性」定義為對比序列並在必要時引入缺口以獲取最大百分比序列同一性後，且不將任何保守替代視為序列同一性的一部分，候選序列中與特定肽或多肽序列中的胺基酸殘基相同的胺基酸殘基的百分率。可以本領域技術範圍內的多種方式進行序列對比以測定百分比胺基酸序列同一性，例如使用公眾可得到的計算機軟體，諸如blast、blast-2、align或megalign(dnastar)軟體。本領域技術人員可決定測量對比的適宜參數，包括對所比較的序列全長獲得最大對比所需的任何算法。
79.當涉及多核苷酸時，本文所用的術語「載體」指用於將核苷酸編碼信息轉移到宿主細胞內的任一種分子(例如，核酸、質粒或病毒等)。術語「表達載體」或「表達盒」指適於在宿
主細胞內表達目的基因(待表達核苷酸序列)的載體，通常包括目的基因、啟動子、終止子、標記基因等部分。
80.本文所用的術語「宿主細胞」指已經或者能夠用核酸序列轉化並從而表達所選的目的基因的細胞。該術語包括親本細胞的後代，無論該後代與原來的親本細胞在形態或基因組成上是否相同，只要後代存在所選目的基因即可。常用的宿主細胞包括細菌、酵母、哺乳動物細胞等。
81.本文所用的術語「轉染」指外來或外源dna被細胞攝入，該技術可用於將一種或多種外源dna部分導入適宜的宿主細胞。可通過理化方法(例如通過氯化鈣處理)誘導細胞，使其處於最適攝取和容納外來dna的生理狀態，即「感受態」。
82.提及藥物組合物時，本文所使用的術語「有效量的」指可對人和/或動物產生功能或活性且可被人和/或動物所接受的量。「藥學上可接受的載體」指用於給藥的載體，包括各種賦形劑、稀釋劑和緩衝劑等，這些物質適合於人和/或動物給藥而無過度的不良副反應，同時適合於維持位於其中的藥物或活性劑的活力。
83.下面將結合具體實施例對本發明的一些方面進行詳細描述。除非另有說明，下文描述的實施例的方法和材料均為可以通過市場購買獲得的常規產品。
84.實施例
85.實施例1鼠源抗人ctla4抗體人源化
86.1)鼠源抗人ctla4抗體42b11g12d3抗體序列(cdr區域採用下劃線顯示)(參見例如seq id no:1-2)
[0087][0088]
2)抗人ctla4抗體cdr移植質粒構建
[0089]
選擇imgt human v gene(f+orf+in-framep)資料庫，根據比對選擇同源性最高的人germline抗體序列作為人源化接收載體，將鼠抗體中三個重鏈互補決定區hcdr1、hcdr2和hcdr3，三個輕鏈互補決定區lcdr1、lcdr2和lcdr3分別轉入相應位置，並且分析翻譯後修飾位點(ptm)，見表1。序列分析顯示w33和m63兩個位點是翻譯後氧化修飾的熱點(參見例如seq id no:3-4)。
[0090]
[0091][0092]
表1：ptm風險分析
[0093][0094]
3)設計噬菌體文庫cbm(灰色底紋)，5bm(加粗)，構建抗人ctla4抗體42b11g12d3vh-vl的phage-fab和faseba-fab質粒，篩選人源化抗體回復突變位點(參見例如seq id no:5-8)。
[0095]
42b11g12d3_cbm
[0096][0097]
42b11g12d3_5bm
[0098]
[0099][0100]
4)原核表達抗體產物親和力排序及其vh/vl序列(表2)，選擇抗人ctla4抗體親和力最高的序列進行真核系統表達。
[0101]
表2：單克隆抗體人源化回復突變篩選，具有最高親和力的抗體親和力排序
[0102][0103]
呈現最高親和力的3條cbm和5條5bm的抗體序列如下(參見例如seq id no:9-24)：
[0104]
[0105]
[0106][0107]
實施例2：人源化抗體重組生產
[0108]
選中的抗體vh、vl序列經密碼子優化後，連接在5』端分泌信號肽後，與人抗體igg1重鏈、kappa輕鏈恆定區序列相連接，分別克隆到ptt5表達載體中製備成為可以在哺乳動物細胞內表達並分泌的人抗體dna序列。質粒採用pei共轉染hek293-6e懸浮培養細胞，進行瞬時表達。轉染時，細胞密度維持在1
×
106細胞/ml，pei:dna比例為3:1。細胞在37℃ 5％co2培養箱中105轉/分鐘震蕩培養。轉染24小時後，加入0.5％trypton n-1。5天後，收集細胞培養上清，抗體使用protein-a瓊脂糖凝膠純化，定量並鑑定純度(表3)。
[0109]
表3：人源化抗體重組生產
[0110][0111]
[0112]
實施例3：人源化單克隆抗體的親和力測定
[0113]
以10μl/min流速的hbs-ep緩衝液平衡晶片表面5分鐘，隨後以10μl/min的流速注射「nhs+edc」的1:1混合液7分鐘來活化晶片，將稀釋在10mm醋酸鈉緩衝液中的捕獲抗體(goat anti-mouse igg)以10μl/min流速注射約7分鐘進行偶聯，最後以10μl/min的流速注射乙醇胺7分鐘進行表面封閉。
[0114]
以hbs-ep緩衝液作為樣品進行三個預循環來平衡晶片使基線穩定，10μl/min流速注射稀釋在hbs-ep緩衝液中的抗體0～5分鐘(通過調整捕獲時間來控制抗體和抗原結合信號在～100ru)，緩衝液平衡1分鐘。以30μl/min流速注射低濃度抗原0.33nm ctla4-fc 5分鐘，抗原與抗體發生結合，之後30μl/min流速注射緩衝液15分鐘進行解離，100μl/min流速注射50mm hcl共四次，每次10秒進行再生，一次循環結束。
[0115]
改變抗原濃度進行下一個梯度濃度的循環測定直到所有梯度濃度(1.25nm、2.5nm、5nm、10nm、20nm、40nm)及重複濃度(如5nm ctla4-fc)測定結束。實驗數據經過雙扣減(對照通道及零濃度)後，在biacore 8k evaluation software中進行「1:1結合」模型的擬合。使用biacore 8k測定抗體針對ctla4-fc重組蛋白的親和力。
[0116]
如圖1和表4所示，特異性針對人ctla4-fc的單克隆抗體(ah01672、ah01674、ah01679、ah01686、ah01695、ah01696、ah01704)對ctla4-fc的親和力由biacore測得均達到sub-nm級至pm級。這些結果表明，本發明篩選到的抗體具有非常高的親和力。
[0117]
表4
[0118][0119]
實施例4：人源化抗人ctla4單克隆抗體的功能性驗證
[0120]
抗人ctla-4抗體的功能檢測分析使用的是promega公司開發的抗ctla-4阻斷分析試劑盒。試劑盒包含兩個細胞系，cd80/cd86 aapc/raji刺激細胞和表達ctla-4的功能細胞。在未加入抗ctla-4抗體的情況下，raji細胞與功能細胞的ctla-4結合從而抑制免疫信號傳遞，不會激活nfκb去結合下遊啟動子序列實現報告基因luc2的表達。當抗人ctla-4抗體加入後，ctla-4蛋白被阻斷，raji細胞激發的免疫反應會被重新激活，功能細胞內的螢光酶會表達並與底物反應，產生的螢光信號可以被檢測收集。
[0121]
試驗中，表達cd80/cd86的raji細胞和表達ctla-4的功能細胞被培養計數。raji細胞按照50000細胞/孔鋪備到96孔板中。樣品抗體和陽性、陰性對照抗體按照梯度加入到raji細胞中，然後按照50000/孔加入功能細胞。在37℃ 5％co2環境中混合孵育6小時。加入螢光反應底物並室溫避光反應10分鐘，然後檢測螢光強度。如果抗體有ctla-4阻斷效果，螢光強度會與增加的抗體濃度呈現反曲線。
[0122]
實驗結果顯示，人源化抗人ctla4單克隆抗體(ah01672、ah01674、ah01679、
ah01695)能夠特異性地解除ctla4的免疫負調節，激活t細胞分泌細胞因子，對應ec50分別為7.310μg/ml、1.115μg/ml、17.10μg/ml、5.464μg/ml(圖2和表5)。選擇ec50較低的ah01674(1.115μg/ml)和ah01695(5.464μg/ml)兩株人源化抗體往前推進做成藥性及熱穩定性的研究。
[0123]
表5
[0124]
抗體名稱yervoy嵌合抗體ah1672ah1674ah1679ah1695ec50(μg/ml)0.93343.9607.3101.11517.105.464
[0125]
實施例5：人源化抗人ctla4單克隆抗體的成藥性評價
[0126]
ah01674和ah01695以及嵌合抗體三個抗體按200ml體系表達，得到5mg以上，內毒素控制在3eu/mg水平的純化抗體樣品供後續實驗所需。
[0127]
1.熱穩定性檢測
[0128]
熱穩定性檢測實驗設置
[0129]
a.抗體樣品濃度》5mg/ml進行耐久試驗。
[0130]
抗體樣品在40℃分別處理，然後離心去除沉澱，再用elisa評估殘留的抗體數量。(40℃處理7天，14天分別檢測，每次檢測同時用存放於-80℃未處理的樣品做對照)
[0131]
b.各抗體樣品濃度》5mg/ml，分別在室溫、30、40、50、60℃五個梯度處理20min，然後離心去除沉澱，再用elisa評估殘留的抗體量。每次檢測同時用存放-80度未處理的樣品做對照。
[0132]
a/b處理樣品同時送測sec-hplc。
[0133]
結果如圖3-5所示，經過熱處理的ah01674、ah01695、嵌合抗體三種抗體樣品沒有出現大量聚集，同時呈現出穩定的抗體與抗原的結合能力。
[0134]
2.成藥性實驗
[0135]
抗人ctla4單克隆抗體cdr區域序列分析顯示(表1)，vh區域預測存在w33、m63位點氧化修飾的熱點。人源化後的抗人ctla4單克隆抗體分別進行
[0136]
a.氧化加壓試驗：抗體分子轉入20mm醋酸銨溶液中(ph5.0)，加入aaph(2,2
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azobis(2-amidinopropane))(50:1)40℃避光處理24小時。
[0137]
b.去醯胺化加壓實驗：抗體分子置於pbs溶液中(ph9)，48h，40℃
[0138]
來判斷氧化修飾/去醯胺修飾對抗體分子的抗原識別能力的影響。處理後的抗體樣品採用質譜檢測判斷相應胺基酸分子發生化學變化的比例，biocore檢測判斷親和力的變化，sec-hplc判斷抗體分子的聚合度變化。
[0139]
結果顯示(表6-8和圖6-7)，質譜檢測覆蓋率都達到了95％左右，得到可信的結果。抗體ah01674對照樣品中，檢測到m@63有9.54％的氧化，在aaph-24處理樣品中，m@63有75.62％氧化。抗體ah01695對照樣品中，檢測到m@63有8.91％的氧化，m@250未檢測到氧化，在aaph-24處理樣品中，m@63有70.90％氧化，m@250有26.14％的氧化。m250位於抗體分子恆定區。所以ah01674和ah01695 cdr序列中m63位點存在發生氧化修飾的可能性。
[0140]
親和力驗證、sec驗證結果顯示，ah01674和ah01695抗體分子氧化加壓處理的沒有影響抗體與抗原的親和力，也沒有影響抗體分子的均一性。
[0141]
同時，去醯胺化加壓實驗質譜分析檢測ah01674和ah01695 cdr序列中沒有發生脫醯胺修飾，這與序列分析結論一致。
[0142]
表6.成藥性檢測分析:人源化抗人ctla4單克隆抗體氧化加壓試驗後質譜檢測
[0143][0144]
表7.成藥性檢測分析:人源化抗人ctla4單克隆抗體氧化加壓試驗後親和力檢測
[0145][0146]
表8.成藥性檢測分析:人源化抗人ctla4單克隆抗體脫醯胺加壓試驗後質譜檢測
[0147]
[0148]
[0149]
[0150]