一種高效降解多環芳烴的複合菌劑、固定化菌劑材料及其製備方法與應用
2024-04-16 05:35:05 2
1.本發明涉及微生物學、生物化學和發酵工程技術領域，特別涉及一種高效降解多環芳烴的複合菌劑、固定化菌劑材料及其製備方法與應用。
背景技術：
2.多環芳烴(pahs)具有毒性、遺傳毒性、突變性和致癌性，可對人體可造成多種危害，如對呼吸系統、循環系統、神經系統損傷，對肝臟、腎臟造成損害，被認定為影響人類健康的主要有機汙染物。環境中的多環芳烴可以通過多種途徑進入人體，進而危害人類健康，因此對多環芳烴汙染的治理和修復受到人們的普遍關注。
3.針對多環芳烴的修複方法主要有物理、化學和生物修復。其中，傳統的物理化學修複方法易造成二次汙染，且處理成本高，使其應用收到了限制。而生物修複方法具有工程量小、能耗低、成本低、環境友好等特點，使其在多環芳烴的汙染修復領域得到了穩定發展和廣泛應用。微生物修復是指通過刺激土著菌或添加外源降解菌劑的方式，在微生物的代謝作用下降解土壤和水體中的汙染物，使汙染物無害化的過程。
4.但是，由於多環芳烴性質穩定，且缺乏高效的降解菌劑，使得微生物修復降解多環芳烴普遍存在效率低，周期長等問題。因此，有必要開發具有生長快、適應性強和降解pahs效果好的多環芳烴的菌劑。
技術實現要素：
5.本發明目的是提供一種高效降解多環芳烴的複合菌劑、固定化菌劑材料及其製備方法與應用，該五種菌的協同作用下，可加速pahs的溶解，增加生物可利用性，有效促進pahs的生物降解。
6.在本發明的第一方面，提供了一種高效降解多環芳烴的複合菌劑，所述高效降解多環芳烴的複合菌劑由2
×
107～6
×
109cfu/ml的保藏編號為cctcc m 2022117的氣單胞菌、1
×
106～1
×
109cfu/ml的斯塔普氏菌、3
×
106～6
×
108cfu/ml的鞘氨醇菌、4
×
106～3
×
108cfu/ml的銅綠假單胞菌和2
×
107～4
×
109cfu/ml的枯草芽孢桿菌按照體積比(30～80)：(5～30)：(5～30)：(5～30)：(10～30)混合組成。
7.所述斯塔普氏菌的保藏編號為cctcc ab 208228；所述鞘氨醇菌的保藏編號為cctcc ab 2010361；所述銅綠假單胞菌的保藏編號為cctcc ab 93066；所述枯草芽孢桿菌的保藏編號為cctcc ab 90008。
8.在本發明的第二方面，提供了一種高效降解多環芳烴的固定化菌劑材料，所述固定化菌劑材料由載體以及吸附在所述載體表面的所述的高效降解多環芳烴的複合菌劑組成。
9.進一步地，所述載體包括：生物炭載體、殼聚糖、海藻酸鹽、聚氨酯、硅藻土、膨潤土、蛭石、礦渣、多孔陶瓷中的一種。
10.所述生物炭載體包括秸稈生物炭、稻殼生物炭、松果生物炭中的一種或多種組合。生物炭載體的製備：將秸稈、稻殼或松果粉碎烘乾後，置於迴轉式電爐中加熱，當升溫至105℃以後通入水蒸氣，保持水蒸氣流量穩定不變，以每分鐘升溫10℃條件下加熱到600～800℃，保溫3～4h後停止加熱，繼續通入水蒸氣，直至溫度低於100℃，待溫度降至常溫後，研磨過篩，用無機強酸浸泡5-6h後洗去灰分，用去離子水衝洗至ph值恆定，在105℃下烘乾，即得生物炭。
11.在本發明的第三方面，提供了所述的高效降解多環芳烴的固定化菌劑材料的製備方法，所述方法包括：
12.將所述氣單胞菌、斯塔普氏菌、鞘氨醇菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌分別擴培，待od600＝1.0
±
0.05時，將所述菌液按所述比例混合，後添加1～5％(w/v)的生物炭載體，吸附培養；
13.在所述吸附培養完成後，在無菌條件下離心，去除上層懸液，獲得固體產物；
14.將所述固體產物冷凍乾燥，獲得高效降解多環芳烴的固定化菌劑材料。
15.在本發明的第四方面，提供了所述的高效降解多環芳烴的複合菌劑在降解多環芳烴中的應用。
16.所述應用的方法包括：
17.對於多環芳烴汙染水體：取所述的高效降解多環芳烴的複合菌劑按5～15％的體積比投加到多環芳烴汙染水體中進行生物降解，保證水體溶解氧2.0～6.0mg/l；
18.針對多環芳烴汙染土壤或沉積物：取所述的高效降解多環芳烴的複合菌劑按5～15％的體積比投加到培養液中，製得菌液，再將所述菌液與汙染土壤或沉積物按1:1～3:1的質量比混合均勻，進行生物降解，保證水體溶解氧2.0～6.0mg/l，攪拌並補充0.1～1.5％體積的表面活性劑以促進多環芳烴的溶解。
19.需要說明的是，所述高效降解多環芳烴的複合菌劑在製備的時候各菌的培養體系不同，其中氣單胞菌、在以pahs芘(byrene)為唯一碳源的液體培養基(1l該培養基成分如下：100mg byrene、1.3～2.0g kh2po4、4.5～6.5g k2hpo3·
3h2o、0.5～2.4g nh4cl、0.4～1.0g nacl、100～500mg mgso4、0～100mg mnso4·
h2o、0～100mg feso4·
7h2o、0～100mg cacl2、10ml tween80，ph＝7.0～7.2，121℃高壓滅菌20min，培養條件為：30℃，轉速200rpm)中進行獨立擴培；
20.斯塔普氏菌在2216e液體培養基(1l該培養基成分如下：5g胰蛋白腖、0.1g檸檬酸鐵、19.45g nacl、5.9g mgcl2、0.55g kcl、3.24g na2so4、1.8g cacl2、0.16g na2co3、0.08g kbr、34mg srcl2、22mg h3bo3、4mg nasio3、2.4mg naf、1.6mg nh4no3、8mg na2hpo4，ph＝7.6，培養條件為：30℃，轉速200rpm)中擴培；
21.鞘氨醇菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌在lb液體培養基(1l該培養基成分如下：10g胰蛋白腖、5g酵母粉、5g nacl，ph＝7.0-7.2，121℃高壓滅菌20min，培養條件為：28℃(鞘氨醇菌)、37℃(銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌)，轉速200rpm)中擴培。
22.所述藥品無特殊說明均採購自中國醫藥集團有限公司。
23.在本發明的第五方面，提供了所述的高效降解多環芳烴的固定化菌劑材料在降解多環芳烴中的應用。
24.所述應用的方法包括：
25.先將所述固定化菌劑材料按4～6g/l的比例投加到培養液中，獲得活化菌液；
26.針對多環芳烴汙染水體：將所述活化菌液按5～15％(v/v)的比例投加到含有多環芳烴汙染物的汙水中，進行生物降解，保證水體溶解氧4.0～7.0mg/l；
27.針對多環芳烴汙染土壤或沉積物：將所述活化菌液按5～15％(v/v)的比例投加到培養液中獲得稀釋後的菌液，後將汙染土壤(沉積物)與所述稀釋後的菌液按1:1～1:3(w/v)的比例混合均勻進行生物降解，保證水體溶解氧4.0～7.0mg/l，攪拌並補充0.1～1.5％體積的表面活性劑以促進多環芳烴的溶解。
28.所述培養液的配方為：
29.1l培養液中的成分如下：1.3～2.0g kh2po4、4.5～6.5g k2hpo3·
3h2o、0.5～2.4g nh4cl、0.4～1.0g nacl、100～500mg mgso4、0～100mg mnso4·
h2o、0～100mg feso4·
7h2o、0～100mg caci2，使得ph＝7.0～7.2，鹽度維持在0.7～1.2％範圍內。
30.本發明實施例中的一個或多個技術方案，至少具有如下技術效果或優點：
31.本發明提供的一種高效降解多環芳烴的複合菌劑、固定化菌劑材料及其製備方法與應用，本發明的複合菌劑中的核心降解菌株氣單胞菌，是從焦化廢水處理廠二沉池的活性汙泥中通過馴化培養富集分離等手段篩選出來的，具有生長快、適應性強和降解pahs效果好等優點。本發明的複合菌劑除了氣單胞菌外，還複合了銅綠假單胞菌、斯塔普氏菌、鞘氨醇菌和枯草芽孢桿菌四種菌株。其中，斯塔普氏菌和鞘氨醇菌均具有良好的pahs降解能力；而銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌具有產生鼠李糖脂等生物表面活性劑的能力。在五種菌的協同作用下，可加速pahs的溶解，增加生物可利用性，有效促進pahs的生物降解。本發明的複合菌劑對多環芳烴的降解效果高，針對400mg/kg的低環pahs(四環及以下)汙染土壤7天可以達到94.5％的降解效果；針對80mg/kg的高環pahs(四環及以上)汙染土壤14天可以達到90.6％的降解效果(如附圖1、附圖2)。
32.本發明的氣單胞菌的保藏日期為2022年2月14日，保藏編號為cctcc no：m 2022117。其分類命名為氣單胞菌(aeromonas sp.bcp-3)，保藏單位名稱為中國典型培養物保藏中心，地址為中國湖北省武漢市武漢大學，郵編：430072。
附圖說明
33.為了更清楚地說明本發明實施例中的技術方案，下面將對實施例描述中所需要使用的附圖作一簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發明的一些實施例，對於本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其它的附圖。
34.圖1為本發明複合菌劑針對土壤低環pahs的降解效果；
35.圖2為本發明複合菌劑針對土壤高環pahs的降解效果；
36.圖3為本發明固定化多環芳烴降解菌劑材料的sem圖；
37.圖4為本發明固定化菌劑材料針對實際汙水中pahs的降解效果；
38.圖5為本發明固定化菌劑材料針對實際土壤中pahs的降解效果。
具體實施方式
39.下文將結合具體實施方式和實施例，具體闡述本發明，本發明的優點和各種效果
將由此更加清楚地呈現。本領域技術人員應理解，這些具體實施方式和實施例是用於說明本發明，而非限制本發明。
40.在整個說明書中，除非另有特別說明，本文使用的術語應理解為如本領域中通常所使用的含義。因此，除非另有定義，本文使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬領域技術人員的一般理解相同的含義。若存在矛盾，本說明書優先。
41.除非另有特別說明，本發明中用到的各種原材料、試劑、儀器和設備等，均可通過市場購買獲得或者可通過現有方法獲得。
42.本發明的氣單胞菌的製備方法如下：
43.本技術發明人從採集於從武漢某焦化廢水處理廠二沉池的活性汙泥中通過馴化培養富集分離等手段篩選出來的一株微生物，發現該菌株具有高效降解多環芳烴的能力，該細菌經菌落形態、生化及16s rrna測序分析，該菌株與氣單胞菌屬(pseudomonas)多個的菌株同源性均在96％以上，結合生理生化特性，初步確定該菌株屬氣單胞菌屬(pseudomonas)，並命名為氣單胞菌菌株(aeromonas sp.bcp-3)。
44.取該氣單胞菌，於lb液體培養基中擴大培養，取新鮮菌液用細菌基因組提取試劑盒提取其基因組。將提取得到的基因組，用通用引物27f和1492r進行pcr擴增，pcr體系為：2x taq plus pcr master mix 25μl、ddh2o 19μl、通用引物27f 2μl、通用引物1492r 2μl、模板dna 2μl。取pcr擴增得到的產物10μl，於1.5％的瓊脂糖凝膠中電泳檢測，確認有清晰明亮的條帶後將剩餘的pcr產物送測序公司測序，測序結果如seq id no:1所述。
45.將測序結果與blast搜索程序從資料庫(ncbi)中基因序列進行比對分析，並構建系統發育樹(圖2所示)，現菌株與氣單胞菌同源性達到了96％。結合生理生化特性，確定菌株為氣單胞菌屬，並命名為氣單胞菌菌株(aeromonas sp.bcp-3)，並於2022年2月14日於中國典型培養物保藏中心進行保藏，保藏編號為cctcc no：m 2022117。
46.與普通的氣單胞菌相比，本發明的氣單胞菌對多環芳烴的降解效果高，針對305mg/l的模擬多環芳烴溶液，7天可以達到90％的降解效果；針對389.81mg/l的實際多環芳烴汙水，14天可以達到92％的降解效果；針對135.53mg/kg的實際多環芳烴汙染土壤，21天可達到74％的降解效果。
47.下面將結合實施例及實驗數據對本技術的一種高效降解多環芳烴的複合菌劑、固定化菌劑材料及其製備方法與應用進行詳細說明。
48.實施例1、高效降解多環芳烴的複合菌劑及其製備方法與應用
49.複合菌劑準備：將五種菌分別在上述獨立的培養體系中擴培，其中氣單胞菌、在以芘(byrene)為唯一pahs碳源的培養液中進行獨立擴培；斯塔普氏菌在2216e液體培養基中擴培；鞘氨醇菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌在lb液體培養基中擴培(各培養基成分和培養條件見上述說明書)。待五種菌液od600＝1.0時，將氣單胞菌、銅綠假單胞菌、斯塔普氏菌、鞘氨醇菌和枯草芽孢桿菌5種菌按55％、10％、10％、10％、15％的佔比混合，測得總活菌數為4.3
×
108cfu/ml。即獲得可降解pahs的複合菌劑，保存備用。
50.低環多環芳烴模擬汙染土壤的製備：取相應質量的5種低環pahs(包括150mg nap、100mg ace、50mg phe、50mg ant以及50mg fla)溶於300ml丙酮溶液中，將該溶液浸沒於1kg模擬土壤中，避光老化7天待丙酮揮發後，即可獲得5種低環pahs的汙染土壤(其中各汙染物含量為：150mg/kg nap、100mg/kg ace、50mg/kg phe、50mg/kg ant、50mg/kg fla)，保存備
用。
51.實驗及測試條件：按1:2的質量比取適量的多環芳烴模擬汙染土壤和培養液(培養液成分詳見上述說明書)置於250ml錐形瓶中，設置對照組(添加總體積10％的培養液)和實驗組(添加總體積10％的複合菌劑)，每組三個平行。在30℃、200rpm條件下，避光振蕩培養21天，間歇性曝氣使得溶解氧維持在2.0-6.0mg/l的範圍內。並於0、1、3、7、14、21天分別取樣，測試體系中殘留pahs的濃度。
52.實驗結果：各pahs組分降解效果如附圖1，為了方便對比實驗組和對照組的降解效果，將7天各pahs組分的降解率匯總如下表1。
53.表1針對低環pahs模擬土壤本發明菌劑的7天降解效果比較(mg/kg)
[0054][0055]
由圖1和表1可知，可知針對400mg/kg的低環pahs本發明菌劑降解效果顯著，7天即可達到94.5％的降解率，14天和21天的降解率分別為99.0％和99.5％。
[0056]
實施例2、高效降解多環芳烴的複合菌劑及其製備方法與應用
[0057]
複合菌劑準備：將五種菌分別在上述獨立的培養體系中擴培，其中氣單胞菌、在以芘(byrene)為唯一pahs碳源的培養液中進行獨立擴培；斯塔普氏菌在2216e液體培養基中擴培；鞘氨醇菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌在lb液體培養基中擴培(各培養基成分和培養條件見上述說明書)。待五種菌液od600＝1.0時，將氣單胞菌、銅綠假單胞菌、斯塔普氏菌、鞘氨醇菌和枯草芽孢桿菌5種菌按50％、12.5％、12.5％、12.5％、12.5％的佔比混合，測得總活菌數為2
×
109cfu/ml。即獲得可降解pahs的複合菌劑，保存備用。
[0058]
高環多環芳烴模擬汙染土壤的製備：取相應質量的5種高環pahs(包括25mg byr、25mg baa、25mg bbf、2.5mg bap以及2.5mg dbaha)溶於300ml丙酮溶液中，將該溶液浸沒於1kg模擬土壤中，避光老化7天待丙酮揮發後，即可獲得5種高環pahs的汙染土壤(其中各汙染物含量為：25mg/kg byr、25mg/kg baa、25mg/kg bbf、2.5mg/kg bap以及2.5mg/kg dbaha)，保存備用。
[0059]
實驗及測試條件：按1:3的質量比取適量的多環芳烴模擬汙染土壤和培養液(培養液成分詳見上述說明書)置於250ml錐形瓶中，設置對照組(添加總體積10％的培養液)和實驗組(添加總體積10％的複合菌劑)，每組三個平行。在30℃、200rpm條件下，避光振蕩培養21天，間歇性曝氣使得溶解氧維持在2.0-6.0mg/l的範圍內。並於0、1、3、7、14、21天分別取樣，測試體系中殘留pahs的濃度。
[0060]
實驗結果：各pahs組分降解效果如附圖2，為了方便對比實驗組和對照組的降解效果，將14天各pahs組分的降解率匯總如下表2。
[0061]
表2針對高環pahs模擬土壤本發明菌劑的14天降解效果比較(mg/kg)
[0062][0063]
由圖2和表2可知，針對80mg/kg的高環pahs本發明菌劑降解效果顯著，14天即可達到90.6％的降解率，21天時的降解率略有提高，為94.1％。
[0064]
實施例3、高效降解多環芳烴的複合菌劑及其製備方法與應用
[0065]
複合菌劑準備：將五種菌分別在上述獨立的培養體系中擴培，其中氣單胞菌、在以芘(byrene)為唯一pahs碳源的培養液中進行獨立擴培；斯塔普氏菌在2216e液體培養基中擴培；鞘氨醇菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌在lb液體培養基中擴培(各培養基成分和培養條件見上述說明書)。待五種菌液od600＝1.0時，將氣單胞菌、銅綠假單胞菌、斯塔普氏菌、鞘氨醇菌和枯草芽孢桿菌5種菌按60％、10％、10％、8％、12％的佔比混合，測得總活菌數為9
×
108cfu/ml。即獲得可降解pahs的複合菌劑，保存備用。
[0066]
實際汙染土壤：從杭州某焦化汙染場地取適量汙染土壤，於陰涼處自然風乾，研磨，過10目篩，除去樹枝等雜質後，保存備用。通過國標法(hj 805-2016)測試表明，該土壤中16種pahs的初始總量為294.20mg/kg，各pahs成分含量見下表3。
[0067]
實驗及測試條件：按1:3的質量比取適量的多環芳烴模擬汙染土壤和培養液(培養液成分詳見上述說明書)置於250ml錐形瓶中，設置對照組(添加總體積10％的培養液)和實驗組(添加總體積10％的複合菌劑)，每組三個平行。在30℃、200rpm條件下，避光振蕩培養21天，間歇性曝氣使得溶解氧維持在2.0-6.0mg/l的範圍內。並於0、7、14天分別取樣，測試體系中殘留pahs的濃度。
[0068]
實驗結果：各pahs組分的降解率匯總如下表3。
[0069]
表3針對實際pahs汙染土壤本發明菌劑的14天降解效果比較(mg/kg)
[0070][0071]
由表3可知，各pahs組分降解效果明顯，針對總量為294.2mg/kg的pahs實際汙染土壤，14天可達到97.1％的降解率。
[0072]
實施例4、高效降解多環芳烴的固定化菌劑材料及其製備方法與應用
[0073]
1、固定化多環芳烴降解菌劑材料的製備
[0074]
生物炭載體的製備：將秸稈和稻殼按1:1(w/w)的比例粉碎烘乾後，置於迴轉式電爐中加熱，當升溫至105℃以後通入水蒸氣，保持水蒸氣流量穩定不變，以每分鐘升溫10℃條件下加熱到600-800℃，保溫3-4h後停止加熱，繼續通入水蒸氣，直至溫度低於100℃，待溫度降至常溫後，研磨過篩，用無機強酸浸泡5-6h後洗去灰分，用去離子水衝洗至ph值恆定，在105℃下烘乾，即得生物炭載體。
[0075]
固定化菌劑材料的製備：首先，將3種菌分別在上述獨立的培養體系中擴培，其中氣單胞菌、在以芘(byrene)為唯一pahs碳源的培養液中進行獨立擴培；銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌在lb液體培養基中擴培(各培養基成分和培養條件見上述說明書)；其次，待3種菌液od600＝1.0時，將氣單胞菌、銅綠假單胞菌、斯塔普氏菌、鞘氨醇菌和枯草芽孢桿菌5種菌按55％、15％、5％、10％、15％的佔比混合，測得總活菌數為4.3
×
108cfu/ml；然後，在混合菌液中加入5％(w/v)的生物炭載體，吸附培養12h；最後，吸附培養完成後，在5000rpm的無菌條件下離心10min，去除上層懸液，並將底部固體產物冷凍乾燥後，即可得到固定化多環芳烴降解菌劑材料。
[0076]
在該條件下製備的固定化多環芳烴降解菌劑材料掃描電鏡圖如圖3所示。由圖3可知，降解菌劑在生物炭載體表面及孔洞中分散均勻，固定情況良好。
[0077]
2、固定化多環芳烴降解菌劑材料對實際汙水中16種pahs的降解效果
[0078]
固定化菌劑材料：按照實施例1的方式製備固定化多環芳烴降解菌劑材料
[0079]
實際汙水：汙水來源為武漢某焦化廢水處理廠調節池池水，經國標法(hj 478-2009)測試分析發現，該汙水初始16種pahs總量為399.32mg/l，各pahs成分含量見下表4。
[0080]
實驗條件：實驗在250ml錐形瓶中進行，反應總體系200ml，設置空白對照組(添加20ml的培養液和180ml的實際汙水)、游離菌劑實驗組(添加20ml激活後的游離菌劑和180ml的實際汙水)和固定化菌劑實驗組(添加20ml激活後的固定化菌劑和180ml的實際汙水)。每組三個平行，置於搖床中，在30℃、200rpm條件下，避光振蕩培養21天，間歇性曝氣使得溶解氧維持在4.0-7.0mg/l的範圍內。並於0、1、3、7、14、21天分別取樣，用國標法(hj 478-2009)測試體系中殘留pahs的濃度。(其中，游離的菌劑是指不負載在生物炭載體上的分散菌劑，其製備方式為各菌種先在獨立的培養體系中分別擴培，待od600＝1.0
±
0.05時，將各菌液按一定比例混合，在無菌條件下離心，去除上層懸液，得到固體產物；將固體產物冷凍乾燥後備用，在使用前需要激活，激活方式與固定化菌劑的激活方式相同；培養液的配方和固定化菌劑的激活參照具體實施方案)
[0081]
實驗結果：實際汙水中pahs降解效果如附圖4，為了方便對比實驗組和對照組的降解效果，將體系中第14天各pahs組分含量匯總如下表4。
[0082]
表4本發明固定化菌劑材料針對汙水中16種pahs的14天降解效果比較(mg/l)
[0083][0084][0085]
由圖4和表4可知，游離菌劑實驗組和固定化菌劑實驗組對汙水中的pahs均具有明顯的降解效果，但是固定化菌劑實驗組優勢明顯，降解速率更快，在降解的第14天就已經趨
於穩定，並達到了98％的降解率。
[0086]
3、固定化多環芳烴降解菌劑材料對實際土壤中16種pahs的降解效果
[0087]
固定化菌劑材料：按照實施例1的方式製備固定化多環芳烴降解菌劑材料
[0088]
實際土壤：土壤來源為徐州某廢棄焦化廠場地用土，於陰涼處自然風乾，研磨，過10目篩，除去樹枝等雜質後，保存備用。經過國標法(hj 805-2016)測試分析發現，該土壤中16種pahs的初始總量為154.68mg/kg，各pahs成分含量見下表5。
[0089]
實驗條件：實驗在250ml錐形瓶中進行，將汙染土壤與培養液(稀釋後的菌液)按1:3(w/v)的比例，設置空白對照組(添加50g多環芳烴實際汙染土壤和150ml培養液)、游離菌劑實驗組(添加50g多環芳烴實際汙染土壤、15ml的激活後的游離菌劑和135ml培養液)和固定化菌劑實驗組(添加50g多環芳烴實際汙染土壤、15ml激活後的固定化菌劑和135ml培養液)。每組三個平行，置於搖床中，在30℃、200rpm條件下，避光振蕩培養21天，間歇性曝氣使得溶解氧維持在4.0-7.0mg/l的範圍內。並於0、1、3、7、14、21天分別取樣，用國標法(hj 805-2016)測試體系中殘留pahs的濃度。(其中，游離的菌劑的製備與激活參考具體實施例2；培養液的配方和固定化菌劑的激活參照具體實施方案)
[0090]
實驗結果：實際土壤中pahs降解效果如附圖5，為了方便對比實驗組和對照組的降解效果，將體系中第21天各pahs組分含量匯總如下表5。
[0091]
表5本發明固定化菌劑材料針對土壤中16種pahs的21天降解效果比較(mg/kg)
[0092][0093]
由圖5和表5可知，針對總量為154.68mg/kg的pahs實際汙染土壤，本發明的固定化菌劑材料降解效果顯著，21天時降解率達到了93.2％，降解效果較游離菌劑實驗組得到了
明顯提升。
[0094]
實驗例1、5種菌單獨降解模擬多環芳烴的能力對比
[0095]
為了體現本發明複合菌劑的協同增效作用，現將五種菌對實際多環芳烴汙水以及實際多環芳烴汙染土壤的降解能力對比如下：
[0096]
(1)針對實際汙水的降解能力對比
[0097]
樣品來源：實際多環芳烴汙水同實施例4中的實際汙水，初始16種pahs總量為399.32mg/l，各pahs成分含量見表4。
[0098]
菌種準備：將氣單胞菌、斯塔普氏菌、鞘氨醇菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌五種菌分別在獨立的培養體系中擴培(各培養基成分和培養條件見上述說明書)。待五種菌的生物量分別達到2
×
107～6
×
109cfu/ml、1
×
106～1
×
109cfu/ml、3
×
106～6
×
108cfu/ml、4
×
106～3
×
108cfu/ml和2
×
107～4
×
109cfu/ml時，保存備用。
[0099]
實驗條件：實驗在250ml錐形瓶中進行，反應總體系200ml，設置氣單胞菌實驗組、斯塔普氏菌實驗組、鞘氨醇菌實驗組、銅綠假單胞菌實驗組和枯草芽孢桿菌實驗組(每個實驗組均添加20ml的菌液和180ml的實際汙水)。每組三個平行，置於搖床中，在30℃、200rpm條件下，避光振蕩培養21天，間歇性曝氣使得溶解氧維持在4.0～7.0mg/l的範圍內。並於14天取樣，用國標法(hj 478-2009)測試體系中殘留pahs的濃度。
[0100]
實驗結果：5種菌對實際汙水的單獨降解能力匯總於表6。
[0101]
(2)針對實際土壤的降解能力對比
[0102]
實際多環芳烴土壤同實施例3中的實際土壤，初始16種pahs總量為154.68mg/kg，各pahs成分含量見表3。
[0103]
菌種準備：同對比例(1)中的菌種準備。
[0104]
實驗條件：
[0105]
通過國標法(hj 805-2016)測試表明，該土壤中16種pahs的初始總量為294.20mg/kg，各pahs成分含量見下表6。
[0106]
實驗及測試條件：按1:3的質量比取適量的多環芳烴模擬汙染土壤和菌液置於250ml錐形瓶中，設置氣單胞菌實驗組、斯塔普氏菌實驗組、鞘氨醇菌實驗組、銅綠假單胞菌實驗組和枯草芽孢桿菌實驗組(每個實驗組均添加15ml的菌液、135ml培養液(培養液成分詳見上述說明書)和50g的實際土壤)(添加總體積10％的菌劑)，每組三個平行。在30℃、200rpm條件下，避光振蕩培養21天，間歇性曝氣使得溶解氧維持在2.0～6.0mg/l的範圍內。並於14天取樣，用國標法(hj 805-2016)測試體系中殘留pahs的濃度。
[0107]
實驗結果：5種菌對實際汙水的單獨降解能力匯總於表6。
[0108]
表6 5種菌對實際汙水以及實際汙染土壤的降解能力對比
[0109][0110][0111]
由表6數據可知，相對於空白對照組而言，氣單胞菌對實際汙水和土壤均具有明顯的降解能力；斯塔普氏菌和鞘氨醇菌具有微弱的降解能力；銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌基本不具有降解能力。而這5種菌形成的複合菌劑則具有非常優異的降解能力，對實際汙水和實際汙染土壤均達到了95％以上的降解效果，實現了「1+1＞2」的協同增效降解目的。
[0112]
上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護範圍之內。
[0113]
最後，還需要說明的是，術語「包括」、「包含」或者其任何其他變體意在涵蓋非排他性的包含，從而使得包括一系列要素的過程、方法、物品或者設備不僅包括那些要素，而且還包括沒有明確列出的其他要素，或者是還包括為這種過程、方法、物品或者設備所固有的要素。
[0114]
儘管已描述了本發明的優選實施例，但本領域內的技術人員一旦得知了基本創造性概念，則可對這些實施例作出另外的變更和修改。所以，所附權利要求意欲解釋為包括優選實施例以及落入本發明範圍的所有變更和修改。
[0115]
顯然，本領域的技術人員可以對本發明進行各種改動和變型而不脫離本發明的精神和範圍。這樣，倘若本發明的這些修改和變型屬於本發明權利要求及其等同技術的範圍之內，則本發明也意圖包含這些改動和變型在內。