一株稻黃單胞桿菌致病變種LA20、引物組合及其應用的製作方法

2024-04-16 03:06:05

一株稻黃單胞桿菌致病變種la20、引物組合及其應用
技術領域
1.本發明屬於微生物技術領域，尤其涉及一株稻黃單胞桿菌致病變種la20、引物組合及其應用。


背景技術：

2.由稻黃單胞桿菌致病變種(xanthomonas oryzaepv.oryzae)引起的白葉枯病是世界上最重要的水稻細菌性病害之一，一般造成減產10％-30％，重則減產50％甚至絕收。在我國，除了新疆、西藏等地未見報導，白葉枯病在全國其餘各水稻產區均有發生和流行，成為危害我國水稻生產的三大流行性病害之一。自20世紀70年代以來，利用抗病基因培育抗病品種防治白葉枯病是最為有效和成功的，據全國農技中心統計2018年全國白葉枯病的發生面積僅約為21萬公頃，偶有局部零星發生。白葉枯病抗性基因類型檢測分析顯示我國北方稻區培育的抗白葉枯病品種主要利用的是xa4、xa5、xa7、xa13、xa21和xa23六個抗病基因；長江中下遊稻區培育的抗病品種主要利用的則是xa5、xa7、xa13、xa21和xa23五個抗病基因；華南稻區培育的抗病品種主要利用的僅有xa5、xa7和xa23三個抗病基因。
3.病原菌和寄主是軍備競賽的關係，寄主產生抗性時，病原菌也會不斷進化來克服寄主抗病基因的抗性。雖然上述水稻xa4、xa5、xa7、xa13、xa21和xa23基因抗性較好、抗譜較寬，對我國大多數白葉枯病原菌小種具有抗性，在抗病育種中被廣泛應用，但隨著病原菌小種的不斷進化，它們的抗病持久性也很難保持。最近兩年長江中下遊地區，白葉枯病「捲土重來」大面積發生流行，原有的白葉枯病抗性品種抗性喪失，這時分離鑑定病原菌新流行株，測試致病性，確定其分類地位和小種類型對於爆發成災機理的研究、相應的水稻抗病基因克隆，抗病種質資源鑑定和評價，抗病品種培育顯得尤為重要。


技術實現要素：

4.有鑑於此，本發明的目的在於提供一株稻黃單胞桿菌致病變種la20、引物組合及其應用，本發明提供的稻黃單胞桿菌致病變種la20能同時克服抗病基因xa4、xa5、xa13和xa7的抗性，使絕大多數水稻品種抗性喪失，引起白葉枯病再次爆發流行。
5.為了實現上述發明目的，本發明提供了以下技術方案：
6.本發明提供了一株稻黃單胞桿菌致病變種la20(xanthomonas oryzaepv.oryzae)，於2022年10月9日保藏於中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為cgmcc no.25881。
7.本發明還提供了一種鑑定上述技術方案所述稻黃單胞桿菌致病變種la20的引物組合，包括xoo163引物對和xoo1429引物對；
8.所述xoo163引物對的上遊引物的核苷酸序列如seq id no.1所示，下遊引物的核苷酸序列如saeq id no.2所示；
9.所述xoo1429引物對的上遊引物的核苷酸序列如seq id no.3所示，下遊引物的核苷酸序列如saeq id no.4所示。
10.優選的，所述引物組合鑑定稻黃單胞桿菌致病變種la20的pcr反應的體系每20μl包括：2
×
kod fx緩衝液10μl，10μm正反引物各0.5μl，kod fx dna聚合酶0.5μl，含模板ddh2o溶液8.5μl。
11.優選的，所述pcr反應的條件包括：95℃預變性5min；98℃變性10s，55℃退火20s，68℃延伸30s，35個循環；最後，68℃延伸7min，4℃保存。
12.本發明還提供了上述技術方案所述的稻黃單胞桿菌致病變種la20在鑑定和/或評價水稻種質資源白葉枯病抗性中的應用。
13.優選的，通過抗病基因鑑定和/或評價水稻種質資源白葉枯病抗性。
14.優選的，所述抗病基因包括xa4、xa5、xa13和xa7基因。
15.本發明的有益效果為：
16.本發明提供的稻黃單胞桿菌致病變種la20能同時克服我國廣泛應用的抗病基因xa4、xa5、xa13和xa7的抗性(以往的稻黃單胞菌株不具備同時克服上述四個基因的能力)，使絕大多數水稻品種抗性喪失，引起白葉枯病再次爆發流行。該流行株是必不可少的重要菌種資源，在白葉枯再次爆發成災機理研究以及作為新的鑑別菌株鑑定評價水稻種質資源抗病性等方面具有巨大應用價值。
17.生物保藏說明
18.稻黃單胞桿菌致病變種la20(xanthomonas oryzaepv.oryzae)，於2022年10月9日保藏於中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為cgmccno.25881，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101。
附圖說明
19.圖1為稻黃單胞桿菌致病變種新流行株la20在psa培養基上的菌落形態；
20.圖2為菌落pcr擴增稻黃單胞桿菌致病變種新流行株la20的16srrna、特有hypotheticalprotein以及16s rrna和電子轉移黃蛋白基因嵌合序列(16s rrna/etf)；m：dna2000bp marker；1-8：la20在psa培養基上生長的單菌落；
21.圖3為稻黃單胞桿菌致病變種新流行株la20對xa4、xa5、xa7、xa13、xa21和xa23的致病性。
具體實施方式
22.本發明提供了一株稻黃單胞桿菌致病變種la20(xanthomonas oryzaepv.oryzae)，於2022年10月9日保藏於中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為cgmcc no.25881。
23.本發明還提供了一種鑑定上述技術方案所述稻黃單胞桿菌致病變種la20的引物組合，包括xoo163引物對和xoo1429引物對。
24.在本發明中，所述xoo163引物對的上遊引物的核苷酸序列如seq idno.1所示，下遊引物的核苷酸序列如saeq id no.2所示，具體如下：
25.seq id no.1：caatgcacacgtggaaaggg；
26.saeq id no.2：cttgcaagggatagaagcgt。
27.在本發明中，所述xoo1429引物對的上遊引物的核苷酸序列如seq idno.3所示，下
遊引物的核苷酸序列如saeq id no.4所示，具體如下：
28.seq id no.3：gcctcggagctatatgccgt；
29.saeq id no.4：taagtctgttgtgaaagccc。
30.在本發明中，所述引物組合鑑定稻黃單胞桿菌致病變種la20的pcr反應的體系每20μl優選包括：2
×
kod fx緩衝液10μl，10μm正反引物各0.5μl，kod fx dna聚合酶0.5μl，含模板ddh2o溶液8.5μl。本發明對模板的獲取方法沒有特殊限定，本領域技術人員按照常規操作即可。
31.在本發明中，所述pcr反應條件優選包括：95℃預變性5min；98℃變性10s，55℃退火20s，68℃延伸30s，35個循環；最後，68℃延伸7min，4℃保存。
32.本發明還提供了上述技術方案所述的稻黃單胞桿菌致病變種la20在鑑定和/或評價水稻種質資源白葉枯病抗性中的應用。
33.優選的，所述水稻種質資源為國際水稻研究所培育的以ir24為輪迴親本的秈稻近等單基因系：ir24(xa18)、irbb1(xa1)、irbb2(xa2)、irbb3(xa3)、irbb4(xa4)、irbb5(xa5)、irbb7(xa7)、irbb8(xa8)、irbb10(xa10)、irbb11(xa11)、irbb13(xa13)、irbb14(xa14)和irbb21(xa21)以及由中國農科院培育的cbb23(xa23)，括號內為品種包含的單一白葉枯抗病基因。
34.本發明優選通過抗病基因鑑定和/或評價水稻種質資源白葉枯病抗性。在本發明中，所述抗病基因優選包括xa4、xa5、xa13和xa7基因。
35.實施例中用到的培養基：
36.psa固體培養基：蛋白腖10g，l-穀氨酸1g，蔗糖10g，瓊脂20g，蒸餾水定容至1l。121℃，高壓滅菌20min。
37.m210液體培養基：酵母提取物4g，酵水解乾酪素8g，蔗糖5g，mgso4·
7h2o 0.3g，蒸餾水定容至1l。121℃，高壓滅菌20min。
38.下面結合實施例對本發明提供的技術方案進行詳細的說明，但是不能把它們理解為對本發明保護範圍的限定。
39.實施例1
40.菌株la20的分離鑑定及純化和保藏
41.1.菌株la20的分離
42.2021年安徽省六安市種植的水稻品種「荃優1606」大面積爆發白葉枯病，採集具有白葉枯病典型症狀的發病葉片，在葉片病健交界處剪取2-3cm，放入75％的酒精中1min、1％的次氯酸鈉溶液中3-5min，然後用無菌水衝洗三遍；再加入1ml無菌水，鑷子擠壓剪碎的葉片，吸取擠壓液100μl按照10
1-108的梯度等比稀釋，最後將各個梯度的等比稀釋液100μl分別塗布在psa培養基平板上，28℃培養4-5天，觀察記錄單菌落特徵。
43.2.菌株la20的鑑定
44.(1)形態學鑑定
45.菌株la20在psa培養基上長出的單菌落呈黃色，圓形凸起且邊緣光滑(圖1)。細胞杆狀，大小0.5-1.0
×
1.0-2.7μm，單個排列，鞭毛單根極生，無芽孢和莢膜。參照《伯傑細菌鑑定手冊》中文第八版(r.e.布坎南等,北京:科學出版社,1984)，la20符合黃單胞桿菌的生長特性，初步確認該菌株隸屬於黃單胞桿菌屬細菌(xanthomonas spp.)。
46.(2)分子鑑定
47.以菌株la20在平板上形成的單菌落為模板，採用菌落pcr反應快速、特異地擴增16s rrna基因(1539bp)、稻黃單胞致病變種特有hypothetical protein基因(163bp)以及16s rrna和etf基因嵌合專化序列(1429bp)，通過獲得的擴增片段的序列同源性來鑑定菌株la20的種屬。
48.pcr反應的模板：la20在psa固體培養基培養4-5天，挑取單菌落溶於8.5μl ddh2o；或者la20在psa液體培養基28℃，200rpm培養48h，取1μl菌液溶於7.5μl ddh2o。
49.pcr反應的引物：見表1，通用引物16srrnaf/r序列參見文獻mondal,k.k.,et al.,plantdiseae,2011,95:1582，特異引物xoo163f/r和xoo1429f/r序列為本發明設計，設計思路為：在ncbi上下載水稻白葉枯病菌xanthomonas oryzae pv.oryzae、細菌性條斑病菌xanthomonas oryzae pv.oryzicola、細菌性穗枯病菌burkholderia glumae、細菌性葉鞘褐腐病菌pseudomonasfuscovaginae、細菌性基腐病菌dickeya zeae的基因組序列信息進行blast分析，選擇只存在白葉枯病菌xanthomonas oryzaepv.oryzae內的基因特有序列設計引物。
50.表1稻黃單胞桿菌致病變種分離株鑑定所用引物序列
[0051][0052][0053]
pcr反應的體系(20μl)：2
×
kod fx緩衝液10μl，10μm正反引物各0.5μl，kod fx dna聚合酶0.5μl，含模板ddh2o溶液8.5μl。
[0054]
pcr反應條件：95℃預變性5min；98℃變性10s，55℃退火20s，68℃延伸30s，35個循環；最後，68℃延伸7min，4℃保存。
[0055]
pcr產物的檢測：擴增產物用濃度為1.5％的瓊脂糖凝膠電泳並用凝膠成像儀觀察，目標片段分別約為1539bp、163bp和1429bp(圖2)。
[0056]
pcr產物的序列比對：擴增的pcr產物直接送擎科生物科技有限公司sanger測序，測序獲得的三段基因序列分別如seq id no.7、seq id no.8和seq id no.9所示。將獲得的三段序列在ncbi資料庫(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)中進行blast分析，結果顯示菌株la20的seq id no.7、seq id no.8和seq id no.9與稻黃單胞致病變種典型株系pxo99a的16s rrna基因、特有hypothetical protein基因以及16s rrna和etf基因嵌合專化序列同源性高度一致，均為100％。
[0057]
結合形態學和分子生物學的鑑定結果，可知菌株la20為稻黃單胞桿菌致病變種，其分類命名為xanthomonas oryzaepv.oryzae。
[0058]
seq id no.7：
[0059]
agagtttgatcctggctcagagtgaacgctggcggcaggcctaacacatgcaagtcgaacggcagcacagtaagagcttgctcttatgggtggcgagtggcggacgggtgaggaatacatcggaatctactctttcgtgggggataacgtagggaaacttacgctaataccgcatacgacctacgggtgaaagcggaggaccttcgggcttcgcgcgattgaatgagccgatgtcggattagctagttggcggggtaaaggcccaccaaggcgacgatccgtagctggtctgagaggatgatcagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattggacaatgggcgcaagcctgatccagccatgccgcgtgggtgaagaaggccttcgggttgtaaagcccttttgttgggaaagaaaagcagtcggttaatacccgattgttctgacggtacccaaagaataagcaccggctaacttcgtgccagcagccgcggtaatacgaagggtgcaagcgttactcggaattactgggcgtaaagcgtgcgtaggtggtggtttaagtctgttgtgaaagccctgggctcaacctgggaattgcagtggatactgggtcactagagtgtggtagagggtagcggaattcccggtgtagcagtgaaatgcgtagagatcgggaggaacatcagtggcgaaggcggctacctggaccaacactgacactgaggcacgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccctaaacgatgcgaactggatgttgggtgcaatttggcacgcagtatcgaagctaacgcgttaagttcgccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagtatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctggtcttgacatccacggaactttccagagatggattggtgccttcgggaaccgtgagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgtccttagttgccagcacgtaatggtgggaactctaaggagaccgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacgaccagggctacacacgtactacaatggtagggacagagggctgcaaacccgcgagggcaagccaatcccagaaaccctatctcagtccggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgcagatcagcattgctgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtttgttgcaccagaagcaggtagcttaaccttcgggagggcgcttgccacggtgtggccgatgactggggtgaagtcgtaacaaggtagccgtatcggaaggtgcggctggatcacctcctt。
[0060]
seq id no.8：
[0061]
caatgcacacgtggaaagggacctcaaaaaaatccagtccggcaccgctctgtcaccgctgctgctagtgcgccaggaaggccagcgcaccgtagttgccgacggctaccaccgtttgtgcgccgtctatcgcttagacgaggacgcttctatcccttgcaag。
[0062]
seq id no.9：
[0063]
gcctcggagctatatgccgtgctgtgtggagtacaaagccaccaacgcgaacatacgactcaattatttagggactcgaagtccccgccttagcctcaacgacacgtttagatagatatctcaaacgctcgctacgtcacaagttataaaagaacatgtctcagcctcaacgctgatccatataaattcttaagtgtgcactacattcagagtggtgggtctgggtagactcgaactaccgacctcacccttatcaggggtgcgctctaaccacctgagctacagacccgaagtcttttcactcaatatggtggagcctgtcgggatcgaaccgacgaccccctgcttgcaaagcaggtgctctcccagctgagctaaggccccaaaagggacttcgcataccgacctgtgccggtatgaatctctgaatgcaggtaatttgtgaggacgcccgacaggacgatgacgtcatgctcaaaaggaggtgatccagccgcaccttccgatacggctaccttgttacgacttcaccccagtcatcggccacaccgtggcaagcgccctcccgaaggttaagctacctgcttctggtgcaacaaactcccatggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcagcaatgctgatctgcgattactagcgattccgacttcatggagtcgagttgcagactccaatccggactgagatagggtttctgggattggcttgccctcgcgggtttgcagccctctgtccctaccattgtagtacgtgtgtagccctggtcgtaagggccatgatgacttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcggtctccttagagttcccaccattacgtgctggcaactaagga
caagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacagccatgcagcacctgtctcacggttcccgaaggcaccaatccatctctggaaagttccgtggatgtcaagaccaggtaaggttcttcgcgttgcatcgaattaaaccacatactccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcagtcttgcgaccgtactccccaggcggcgaacttaacgcgttagcttcgatactgcgtgccaaattgcacccaacatccagttcgcatcgtttagggcgtggactaccagggtatctaatcctgtttgctccccacgctttcgtgcctcagtgtcagtgttggtccaggtagccgccttcgccactgatgttcctcccgatctctacgcatttcactgctacaccgggaattccgctaccctctaccacactctagtgacccagtatccactgcaattcccaggttgagcccagggctttcacaacagactta。
[0064]
3.菌株la20的純化和保藏
[0065]
la20鑑定為稻黃單胞桿菌致病變種後，在psa培養基上挑取單菌落到m210液體培養基中，於28℃下200rpm培養48h，菌液與50％的滅菌甘油以體積比1:1混合後放入-80℃冰箱保存備用。並對其進行了保藏，保藏單位：中國普通微生物菌種保藏管理中心(地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏日期為：2022年10月9日，保藏編號：cgmcc no.25881。
[0066]
實施例2
[0067]
菌株la20的致病性測定和水稻品種抗病性評價
[0068]
1.接種水稻材料的選擇和種植
[0069]
接種的水稻材料選用國際水稻研究所培育的以ir24為輪迴親本的秈稻近等單基因系：ir24(xa18)、irbb1(xa1)、irbb2(xa2)、irbb3(xa3)、irbb4(xa4)、irbb5(xa5)、irbb7(xa7)、irbb8(xa8)、irbb10(xa10)、irbb11(xa11)、irbb13(xa13)、irbb14(xa14)和irbb21(xa21)以及由中國農科院培育的cbb23(xa23)，這些水稻材料遺傳背景清楚，la20的致病性可以和抗病基因一一對應。每份接種材料種植4行，每行6株，行間距為20cm，株距為16cm，3次重複；水稻材料播種時間與大田生產播種時間相同或適當調整，以使植株接種期和發病期能夠與適宜水稻白葉枯病發生流行的氣候條件(日均氣溫約30℃，相對溼度大於75％)相遇，確保致病性測定結果的準確性。
[0070]
2.接種體的製備
[0071]
取-80℃凍存的菌株la20在psa培養基平板上劃線培養4-5天，挑取單菌落到約2-3ml m210液體培養基中，於28℃下200rpm培養48h，再以1:100的比例轉接到新的m210液體培養基中擴大培養至od
600
值約為0.5，作為接種體以備用。
[0072]
3.接種
[0073]
水稻孕穗期，於下午16:00-18:00時進行剪葉接種，剪刀蘸取配置的od
600
值約為0.5的la20菌液，剪除劍葉頂端2-3cm，每份水稻材料接種6株，每株接種3-5片劍葉，重複3次。
[0074]
4.病情調查
[0075]
接種21天後，觀察接種材料的發病情況，測量病斑長度，每株測量發病最嚴重的劍葉的病斑長度，每份接種材料測量6株，重複三次，統計平均病斑長度佔接種葉片總長的比率。
[0076]
5.致病性測定和水稻品種抗病性評價
[0077]
根據我國白葉枯病病情分級和抗性類型劃分標準(方中達等,中國水稻白葉枯病菌致病型的研究,植物病理學報,1990,20:81-87)：病斑長度小於接種葉長的四分之一為抗
病(r)，大於或等於接種葉長的四分之一為感病(s)，對la20的致病性進行測定和評價，結果見表2。
[0078]
表2稻黃單胞桿菌致病變種新流行株la20在水稻鑑別品種中的致病性
[0079][0080][0081]
如表2所示：la20侵染21天後，ir24(xa18)、irbb1(xa1)、irbb2(xa2)、irbb3(xa3)、irbb4(xa4)、irbb5(xa5)、irbb7(xa7)、irbb8(xa8)、irbb10(xa10)、irbb11(xa11)、irbb13(xa13)和irbb14(xa14)十二個鑑別品種的平均病斑長度達到12.7-27.0cm，是接種葉長的0.34-0.73，大於四分之一，對la20表現為感病，la20對其具有致病性；僅僅irbb21和cbb23的病斑長度為7.9cm和3.5cm，分別佔接種葉長的0.21和0.14，小於四分之一，對la20表現為抗病(圖3)。這結果意味著菌株la20能完全克服xa18、xa1、xa2、xa3、xa4、xa5、xa7、xa8、xa10、xa11、xa13和xa14十二個基因的抗性，但還不能完全克服xa21和xa23基因的抗性，xa21和xa23對la20還具有一定抗性。
[0082]
參照楊萬風等(2006)報導的採用irbb5、irbb13、irbb3、irbb14、irbb2和ir24作為鑑別品種的水稻白葉枯病菌致病性分型標準r1-r9型(中國水稻白葉枯病菌毒性變異研究,植物病理學報,2006,36:244-288)，la20歸為r9型，irbb5等六個鑑別品種對其均表現為感病；但同已報導的強致病性r9型不一樣的是，la20還可以完全克服水稻品種中廣泛應用的
廣譜且抗性持久的xa7抗病基因的抗性(表2)，這表明la20是病原菌為克服水稻抗性進化出的比現存的r9型強致病株致病性更強的新流行株。
[0083]
對於水稻白葉枯病的抗病育種，我國水稻品種中廣泛應用的是xa4、xa5、xa7、xa13、xa21和xa23六個抗病基因，上述結果顯示去年從安徽分離的la20新流行株已完全能克服xa4、xa5、xa7和xa13的抗性(圖3)，導致含有這四個基因的抗病品種抗性喪失，這可能是水稻白葉枯病「沉寂」後，近兩年卻在長江中下遊地區再度爆發流行的原因。
[0084]
以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍。