免疫抑制劑的定量法的製作方法

2023-12-10 12:52:57 4

專利名稱：免疫抑制劑的定量法的製作方法
技術領域：
FK506和環孢菌素A是一類能夠阻止鈣調神經磷酸酶(Calcineurin)的作用的免疫抑制劑。本發明即是有關這類免疫抑制劑的正確定量方法的，能應用於醫學領域。
背景技術：
以下面的結構式和化學名稱表示FK506或稱FR-900506，這種化合物有很強的免疫抑制作用，可用於器官移植的排斥反應或自體免疫疾病的預防藥物和治療藥物，這是眾所周知的(如EP-0184162-A2)。 化學名稱17-烯丙基-1，14-二羥基-12-[2-(4-羥基-3-甲氧基環己基)-1-甲代乙烯基]-23，25-二甲氧基-13，19，21，27-四甲基-11，28-二氧雜-4-氮雜三環[22.3.1.04，9]二十八碳-18-烯-2，3，10，16-四酮。
對FK506免疫抑制作用機理進行研究後認為，FK506與細胞質內的FK506結合蛋白FKBP-12結合後，同鈣調素和鈣離子等一起與鈣調神經磷酸酶形成複合物(FK506∶FKBP-12∶鈣調神經磷酸酶＝1∶1∶1)。結果，鈣調神經磷酸酶的磷酸酶活性失去，這種磷酸酶失去活性便導致活性T細胞的核因子(NFAT)的活化受到抑制，阻止了IL2的產生，最終起到了免疫抑制作用。
另外，人們認為顯示相同免疫抑制作用的環孢菌素A也形成同樣的複合物而具有免疫抑制作用的。(如參考生物化學與生物物理研究通信，192(3)，1388-1394(1993)和Angew，Chem，Int.Ed Engl，31(1992)384-400)。
作為免疫抑制劑，FK506的可用性得到了較好的研究，在日本特別作為肝移植時的排斥反應抑制劑已經成為商品出售。
但是，由於其抑制作用極強，所以最佳給藥劑量便成了重要問題。適宜的給藥劑量在避免副作用發生及發揮有效的免疫抑制活性作用方面都是極為重要的。
因此，人們提出了幾種測定方法(如參考Clin，Chem.38/7，1307-1310(1992))。如利用能識別FK506中抗原決定簇的抗體的酶免疫測定法(如EP-0293892-A2)、上述酶免疫測定法和HPLC聯合法以及利用FK506結合蛋白(FKBP-12)的放射受體法等。
一方面，由代謝機理可知，FK506在生物體內進行代謝，其代謝產物中有某些物質混在其中，如仍具有免疫抑制活性的物質或與FK506相對的能與單克隆抗體結合的物質等，這種物質的免疫抑制活性極弱(如藥物代謝與處置，21(6)，971-977(1993))。
另外，還有與FK506結合蛋白(FKBP)結合的、不具有免疫抑制活性的物質存在(如506BD)。(如Angew，Chem，Int，Ed，Eng1.31(1992)384-400)。
因此，能識別FK506抗原決定簇的抗體與FK506的結合、FKBP和FK506的結合，僅僅以此為指標的過去的那些測定方法，很難說是正確測定了實際的免疫抑制狀態。可望能開發一種正確測定包括具有免疫抑制活性的代謝產物在內的活性藥物總濃度的方法。

發明內容
本專利的發明者們基於FK506或環孢菌素A這一類的免疫抑制劑與免疫親和素(immunophilin)(與FKBP-12或環啡林(Cyclophilin)這類免疫抑制劑相結合的蛋白)結合後，與鈣調神經磷酸酶(Calcineurin)、鈣調素、鈣離子形成複合物可阻斷鈣調神經磷酸酶的活性這一事實，利用它們的複合物形成，成功確定了免疫抑制劑的定量法。
即本發明提供了由(1)免疫親和素、(2)鈣調神經磷酸酶、(3)鈣調素、(4)鈣離子及(5)對具有阻斷鈣調神經磷酸酶作用的由免疫抑制劑組成的複合物進行定量發析，由複合物的定量而得具有阻斷鈣調神經磷酸酶作用的免疫抑制劑的定量法。
下面就本發明範圍中包含的各種定義及成功的實例子以詳細說明。
「免疫親和素」是指與免疫抑制劑結合的細胞質內的受體蛋白。例如，分子量約為12K的FK506結合蛋白中具有PPIase活性的FKBP-12、環孢菌素A的細胞受體中同樣具有肽基脯氨醯反式-順式異構酶(PPIase)活性的、分子量約17K的免疫親和素等。較為理想的是牛和人類哺乳動物產生的FKBP-12和環啡林。
這是眾所周知的。在美國化學聯合會雜誌113，1409-1411(1991)及美國國家科學院院刊88，6229-6233(1991)；自然346，671-674(1991)；WO92/01052；WO91/17439；自然，337，473-475，476-478(1989)；特開平2-209897等資料均有同樣說明。
鈣調神經磷酸酶是鈣離子和鈣調素賴以存在的絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶這是眾所周知的，可由鼠、牛和人類哺乳動物獲得並使用。例如大鼠和牛的鈣調神經磷酸酶是由A、B兩種亞基形成的雜二聚體，而A亞基又有Aα和Aβ兩種，這可由大鼠腦中分離、純化而得(如參考神經化學雜誌58，1643-1651(1992))。另外，牛的鈣調神經磷酸酶參照酶學進展61，149-200(1989)或酶學方法102，244-256(1983)即可獲得。另外Upstate Biotechonology有限公司和Sigma公司以蛋白鈣調神經磷酸酶等商品在市場上銷售，這些均可使用。
「鈣調素」作為鈣結合蛋白是一種眾所周知的物質，在鈣離子存在下，它可活化前述的鈣調神經磷酸酶等的各種酶。牛和人類哺乳動物的鈣調素即可使用。如牛的鈣調素與生物化學雜誌87，1313-1320(1980)同樣承制，即可獲得。也可以使用Upstate Biotechnology有限公司或Sigma公司的銷售產品。
本發明中要定量的「具有抑制鈣調神經磷酸酶作用的免疫抑制劑」，是指由免疫親和素、免疫親和素鈣調神經磷酸酶、鈣調素和鈣離子共同形成複合物，使鈣調神經磷酸酶的磷酸酶活性失去，從而具有免疫抑制活性的化合物。較為理想的例子，如下所示的化合物[I]式中，R1為羥基或被保護的羥基；R2為氫、羥基或被保護的羥基；R3為甲基、乙基、丙基或烯丙基；R4為羥基或甲氧基；R5為氫或R4、R5一起形成氧代；n為1或2的整數，實線和虛線表示的符號是指單鍵或雙鍵。但R4為羥基同時R5為氫，或R4、R5一起形成氧代時(R2不是被保護的羥基)。
上述通式〔I〕中使用的符號說明及後記說明中使用的「低級」一詞，如無特別指明，就是指碳原子數為1～6個。
「被保護的羥基」中合適的保護基團如下例示甲硫甲基、乙硫甲基、丙硫甲基、異丙基硫甲基、丁硫甲基、異丁基硫甲基、己硫甲基等低級烷基硫甲基一類的l-(低級烷基硫)(低級)烷基、優選的為C1～C4的烷基硫甲基、最優選的是甲硫甲基；三甲基甲矽烷基、三乙基甲矽烷基、三丁基甲矽烷基、叔丁基-二甲基甲矽烷基、三叔丁基甲矽烷基等三(低級)烷基甲矽烷基；甲基二苯基甲矽烷基、乙基二苯基甲矽烷基、丙基二苯基甲矽烷基、叔丁基二苯基甲矽烷基等低級烷基-二芳基甲矽烷基，象這些三取代甲矽烷基中，較好的是三(C1～C4)烷基甲矽烷基及C1～C4烷基二苯基甲矽烷基，最好的是叔丁基二甲基甲矽烷基和叔丁基二苯基甲矽烷基；還有由羧酸、磺酸和氨基甲酸衍生的脂肪醯基、芳香醯基以及以芳基取代的脂肪醯基等。
關於上述醯基，舉出更為詳細的具體實例進行如下說明。
脂肪醯基如甲醯基、乙醯基、丙醯基、丁醯基、異丁醯基、戊醯基、異戊醯基、三甲基乙醯基、己醯基、羧乙醯基、羧丙醯基、羧丁醯基、羧己醯基等可含有一個以上羧基之類適當取代基的低級鏈烷醯基；如環丙氧乙醯基、環丁氧丙醯基、環庚氧丁醯基、氧乙醯基、氧丙醯基、氧丁醯基、氧戊醯基、氧己醯基等可含有一個以上被低級烷基這種適當的取代基所取代的環基(低級)烷氧基(低級)鏈烷醯基、樟腦磺醯基如羧甲基氨基甲醯基、羧乙基氨基甲醯基、羧丙基氨基甲醯基、羧丁基氨基甲醯基、羧戊基氨基甲醯基、羧己基氨基甲醯基等羧基(低級)烷基氨基甲醯基；另外如三甲基甲矽烷基甲氧羰基乙基氨基甲醯基、三甲基甲矽烷基乙氧羰基丙基氨基甲醯基、三乙基甲矽烷基乙氧羰基丙基氨基甲醯基、叔丁基二甲基甲矽烷基乙氧羰基丙基氨基甲醯基、三甲基甲矽烷基丙氧羰基丁基氨基甲醯基等三(低級)烷基甲矽烷基(低級)烷氧羰基(低級)烷氨甲醯基之類保護羧基(低級)烷基氨基甲醯基的含有一個以上羧基或保護羧基取代的烷基氨基甲醯基。
芳醯基如苯甲醯、甲苯醯、二甲苯甲醯、萘醯、硝基苯甲醯、二硝基苯甲醯、硝基萘甲醯等可含有一個以上為硝基等適當基團取代的芳醯基，如苯磺醯、甲苯磺醯、二甲苯磺醯、萘磺醯、氟代苯磺醯、氯代苯磺醯、溴代苯磺醯、碘代苯磺醯等可含有一個以上滷素之類適當取代基的芳磺醯基。
以芳基取代的脂肪醯基如苯乙醯、苯丙醯、苯丁醯、2-三氟甲基-2-甲氧基-2-苯乙醯基、2-乙基-2-三氟甲基-2-苯乙醯基、2-三氟甲基-2-丙氧基-2-苯乙醯基等可含有一個以上(低級)烷氧基和三滷化(低級)烷基一類適當取代的鏈烷醯基。
上述醯基中，較好的醯基是可含羧基的C1～C4的鏈烷醯基，環烷基部分含有2個(C1～C4)烷基的環(C5～C6)烷氧基(C1～C4)鏈烷醯基、樟腦磺醯基、羧基(C1～C4)烷基氨基甲醯基、三(C1～C4)烷基甲矽烷基(C1～C4)烷氧羰基(C1～C4)烷基氨基甲醯基，可含一、二個硝基的苯醯基、含有滷素的苯磺醯基、含有C1～C4烷氧基和三滷代(C1～C4)烷基的苯(C1～C4)鏈烷醯基，其中最為理想的是乙醯基、羧丙醯基、氧乙醯基、樟腦磺醯基、苯醯基、硝基苯醯基、二硝基苯醯基、碘代苯磺醯及2-三氟甲基-2-甲氧基-2-苯乙醯基等。
前述一般式〔I〕所表示的化合物及其合成法已周知，如參照EP-0184162-A2或EP-0353678-A2的方法可得。特別是表示為ER900506(＝FK506)、FR900520、FR900523及FR900525的化合物，其獲得可參考EP-0184162-A2中記載的鏈黴菌屬，特別是Streptomyces tsukubaensis No.9993 (FERM BP 927號)或吸水鏈黴菌yakushimaensis亞種NO.7238(FERM BP-928號)另外，在美國專利4,117,118、4,215,199、4,228,431、4,388,307、Helv.Chim.Acta 60，1568(1977)和65，1655(1982)、Transplant.Proc.17，1362(1985)中可知，如環孢菌素A、B、C、D、E、F、G等的環孢菌素或其衍生物也可與環孢親和素、鈣調神經磷酸酶、鈣調素和鈣離子形成複合物，成為具有阻斷鈣調神經磷酸酶作用的免疫抑制劑，因而可利用本發明的定量法進行測定。
本發明中免疫親和素、鈣調神經磷酸酶、鈣調素、鈣離子及對鈣調神經磷酸酶具有阻斷作用的免疫抑制劑的複合物，其製得方法沒有特別的特點，只是將免疫親和素、鈣調神經磷酸酶、鈣調素和鈣離子同含有對鈣調神經磷酸酶具有阻斷作用的免疫抑制劑的試樣在適當的溶劑中利用常規方法進行反應而得的。
例如將各成分在適當的緩衝溶液中加熱至30～40℃，放置數小時即可。
另外，在醫療實際應用該定量法時，所謂「含有具有對鈣調神經磷酸酶起阻斷作用的免疫抑制劑的試樣」就是指接受對鈣調神經磷酸酶起阻斷作用的免疫抑制劑的患者的血液或血漿，如按EP-0293892-A2所示進行SepPak處理、或用二氯甲烷、甲醇等提取液進行預處理將是更為理想的。
所得到的複合物，用適當的方法分離後，再以放射性同位素或酶標記各成分，或者利用識別複合物某個部位的抗體，用這種常規方法定量測定複合物，從而能夠定量測定目標物免疫抑制劑。
本發明以如下的具體方法實施。另外，以下將「具有對鈣調神經磷酸酶有阻斷作用的免疫抑制劑」簡記為「免疫抑制劑」。(1)將複合物中某一適當的成分以常規的方法固定在金屬板、試管或有孔玻璃珠等固相上，這樣將複合物固定在固相上，複合物製得後很容易地將其從含有不需要成分的反應液中分離出來。
固定在固相上的，複合物組成成分中適當的成分是指免疫親和素、鈣調神經磷酸酶和鈣調素。(1-1)例如固定在固相上的過剩的免疫親和素和過剩的鈣調素、鈣離子及含有用來測定鈣調神經磷酸酶的免疫抑制劑的試樣共同反應，生成同所含免疫抑制劑相當量的複合物。然後，通過反應液的吸濾及適當的緩衝液淋洗，將複合物分離出來。再利用能識別鈣調神經磷酸酶或鈣調素的適當的酶標記抗體，即可對複合物即形成複合物的免疫抑制劑進行定量測定。
所謂的「識別鈣調神經磷酸酶或鈣調素的酶標記抗體」，即是利用常規方法將通常用於酶免疫測法的酶(如過氧物酶，β-D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、鹼性磷酸酶、乙醯膽鹼脂酶、葡糖-6-磷酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶或脲酶等)結合起來的抗鈣調神經磷酸酶抗體或抗鈣調素抗體。
上述酶標記抗體發生作用後，可以通過EP-0293892-A2中所述的常規方法測定標記用的酶的活性，從而定量測定複合物的量。如標記所用酶為過氧物酶時，以0-苯基二胺和過氧化氫水溶液為酶低物溶液；酶為鹼性磷酸酶時，以磷酸4-甲基 繖形酮 酯為酶底物溶液，分別測定其顯色度，從而可知複合物量。(1-2)(1-1)中的「識別鈣調神經磷酸酶或鈣調素的酶標記抗體」可用識別鈣調神經磷酸酶或鈣調素抗體(第一抗體)及識別第一抗體的酶標記抗體(第二抗體)代替。
上述第一抗體及(1-1)中使用的抗鈣調神經磷酸酶抗體或抗鈣調素抗體，可用以鈣調神經磷酸酶或鈣調素為抗原而製得的多克隆抗體或單克隆抗體(如神經化學雜誌58(5)、1643-1651(1992))，同樣可使用由Upstate Biotechnology公司銷售的抗鈣調神經磷酸酶抗體(＝抗蛋白鈣調神經磷酸酶)或抗鈣調素抗體。這些抗體的類型沒有特別限定，但IgG較好、可利用小鼠體免疫或類似的方法所得抗體。
上述的第二抗體，可以用能識別第一抗體的多克隆抗體或單克隆抗體，也可使用將(1-1)中所述的酶以常規方法結合起來的抗體。例如，以鹼性磷酸酶標記的抗免IgG市場有售，可從美國的VECTORLabs.研究所購買使用。(1-3)另外，將過量的免疫親和素固定於固相，如(1-1)所述，製得複合物時，在使用一般的鈣調神經磷酸酶或鈣調素之前，先利用如前述的酶或放射性同位素(如125I等)標記的鈣調神經磷酸酶或鈣調素，將生成的與所含免疫抑制劑等量的複合物以酶活性或放射性劑量為指標進行常規測定。(1-4)不僅是免疫親和素，也可以將過量的鈣調神經磷酸酶或鈣調素固定於固相。這是加入過量的免疫親和素鈣離子和試樣，如前述同樣操作可製得並分離複合物，然後利用以常規方法製得的「適當的酶標記的、能識別免疫親和素的抗體」(酶標記抗免疫親和素抗體)定量測定複合物量。另外，還可使用如(1-2)中所述的識別免疫親和素的第一抗體及能識別第一抗體的酶標記第二抗體。(2)組成複合物的成分不固定也可以分離製得的複合物。即使用能識別複合物某一組成成分的抗體，進行沉澱，分離即可。(2-1)如使用識別鈣調神經磷酸酶或鈣調素的抗體可將複合物沉澱、分離，這時以含有一定量的用3H一類放射性元素標記的免疫抑制劑來定量測定。(2-2)也可如國際申請公開WO94/04700一樣，利用識別製得的免疫親和素的多克隆和單克隆抗體將複合物沉澱，分離出來。這時將生成複合物時所利用的鈣調神經磷酸酶和鈣調素與(1-3)同樣，以適當的酶或放射性同位素(如125I)標記，然後用常規方法定量測定複合物。
另外，上述(2-2)、(1-3)及(1-4)中用來標記的適當的酶，與(1-1)中所敘述的一樣。
前面我們介紹了各種測定方法，較好的是固定於固相的過量免疫親和素與過量鈣調神經磷酸酶、鈣調素、鈣離子及樣品中的免疫抑制劑反應，生成與免疫抑制劑對應量的複合物，分離處理後，以酶免疫測定法定量測定構成複合物的鈣調神經磷酸酶的量，從而定量測定免疫抑制劑。這時，作為酶免疫測定法，最好用過氧物酶或鹼性磷酸酶等常用酶標記的抗鈣調神經磷酸酶抗體或兩種抗體即抗鈣調神經磷酸酶抗體和上述酶標記的抗IgG抗體。
本發明的定量法，用自動或非自動(手動)方法均可實行。
另外在應用本定量法時，可提供方便的試劑盒。試劑盒可含有免疫親和素、鈣離子、鈣調素、鈣調神經磷酸酶和全部或部分作為標準品的免疫抑制劑。也可以含有相應放射性同位素標記的免疫抑制劑、適當的酶或放射性同位素標記的鈣調神經磷酸酶或鈣調素、適當的酶標記的抗免疫親和素抗體或抗鈣調神經磷酸酶抗體及抗鈣調素抗體、抗免疫親和素抗體、抗鈣調神經磷酸酶抗體或抗鈣調素抗體等。
另外，在生成複合物時，通常使用鈣離子，但其它可與鈣調神經磷酸酶、鈣調素和免疫抑制劑共同形成複合物的離子也可以使用。如生物化學與生物物理研究通信192(3)，1388-1394(1993)用錳離子同樣形成複合物並得以確證。
還有，只要對生成的複合物的分離、定量沒有影響，可以向由免疫親和素、鈣調神經磷酸酶、鈣調素、鈣離子和具有阻斷鈣調神經磷酸酶作用的免疫抑制劑形成的複合物中加入其它成分。
下面由實施例說明本發明。製備例1FKBP-12的製備以自然，346，671-674(1990)中哈佛大學S.LSchreiber等報導了DNA序列為基礎。由此利用Applied Biosystem公司的DNA合成儀合成了FKBP-12C末端相應的DNA48聚體5′-CCACATGCCACTCTCGTCTTCGATGTGGAGCTTCTAAAACTGGAATGA-3』將該48聚體用25P標記並用做探針。對一種T細胞cDNA文庫HL1016b 的500,000個菌斑進行篩選，從中得到一個陽性菌斑。從該菌斑中，一個含FKBP-12cDNA亞克隆[pUC-23(Ec)]。該pUC-23(Ec)的測序發現對應於該DNA序列的N末端的第1～32核苷酸缺失。在補齊該缺陷位點之後，該亞克隆與一個約80b.p的富含AT的同義突變的合成的為增強其在大腸桿菌中的表達的合成的N-末端DNA一起插入，該插入是做為EcoRI-BamHI位點插入到一個能在色氨酸啟動子控制下進行基因表達的質粒中的，其製備如生物化學雜誌101，123-134(1987)，中所述，從中可得到一個表達載體，KBP333。使用該載體，將其轉入大腸桿菌HB101 中並產生一個表達細胞系，HB101/pFKBP(AT)311。將細胞在L-氨苄青黴素培養基中培養19小時並加入IAA(吲哚乙酸)致終濃度90μg/ml以誘導蛋白合成。收集大腸桿菌細胞並在50mM Tris-HCl，2mM β-ME，2mM CaCl2，10mM MgCl2和5％甘油中用French Press破碎細胞，接著進行離心(4℃，6,000×g，30分鐘)。上清在60℃熱處理15分鐘並且接著離心(4℃，6,000×g，45分鐘+4℃，18,000×g，20分鐘2次)，透析[20mM Tris-HCl(pH7.4，4℃，過夜]並進行DEAE-Toyo Pearl，650M反相HPLC(C4)，以純化FKBP-12。
使用這樣得到的FKBP-12和含下述組合物的無鈣、鎂離子的磷酸緩衝液，製得溶於磷酸緩衝液中的FKBP-12(50μg/ml)。磷酸緩衝液(pH7.4)組合物氯化鈉 8.0g氯化鉀 0.2g無水磷酸氫二鈉(Na2HPO4) 1.15g無水磷酸二氫鉀(KH2PO4)0.2g加入蒸餾水至1000ml。實施例1 FK506的測定法(1)將製備例1所得磷酸緩衝液FKBP-12(50μg/ml)100μl加到免疫微型滴定板中，將其在4℃下振蕩過夜，然後用製備例1同樣的磷酸緩衝液洗三次，將FKBP-12固定在孔中。向各孔中加入下述組成的測定緩衝液(300μl)，15分鐘後去除溶液，各孔中剩餘的蛋白結合位點被阻斷。
測定緩衝組合物tris-鹽酸鹽 (50mM，pH 7.5)牛血清白蛋白 (5mg/ml)Triton (0.001％)DTT (0.5mM)氯化鈣 (1mM)(2)然後，將遵從下述要點製得的牛鈣調神經磷酸酶粗提液(50μl)、牛鈣調素液(50μl)及FK506溶液(100μl)的稀釋液分別加到各孔中，將板在37℃下放置1小時，使其形成複合物。
牛鈣調神經磷酸酶粗提液將以常規方法配製的溶於20mM tris-鹽酸鹽(pH＝7.0)溶液(5mg/ml)的粗產品用前述測定緩衝液稀釋40倍。
牛鈣調素溶液將市場銷售的牛鈣調素以前述測定緩衝液適當稀釋(配製為孔中最終濃度95nM)。
FK506溶液將FK506的甲醇溶液(1mg/ml)以前述測定緩衝液適當稀釋。(3)以不含牛血清白蛋白的前述測定緩衝液洗各孔(4次)，然後以眾所周知的方法如神經化學雜誌58，1643-1651(1992)，加入以測定緩衝液適當稀釋的識別鈣調神經磷酸酶Aα鏈的兔多克隆抗體(100μl)，室溫下反應一小時。(4)以不含牛血清白蛋白的前述測定緩衝液洗各孔(4次)，然後加入測定緩衝液稀釋的以鹼性磷酸酶標記的抗兔IgG(100μl)(VectorLaboratories)。(5)以不含牛血清白蛋白的測定緩衝液洗各孔(4次)，然後各加200μl以下列方法製得的4-甲基繖形酮磷酸酯(以下簡記為4-MU)底物溶液(1mM)，室溫下經20分鐘後利用螢光計2350(商標Millipore美國有限公司製造)，進行螢光分析(激發波長360nm，發射波長460nm)。結果如表1所示。
表1FK506及其代謝物的定量測定FK506及其螢光強度(平均值±標準誤差(n＝3))代謝物濃度(ng/ml) FK506 M-II M-III0 762.8±192.3 885.3±34.6948.3±16.33.91302.3±4.9 1318.8±9.9962.3±12.07.8 1591.3±41.7 1639.8±36.8967.8±43.815.6 1933.3±112.4 1883.3±98.3 936.8±0.031.3 2131.3±119.5 2188.8±0.0 892.8±134.462.5 2753.8±67.9 2472.3±55.9 1033.3±16.3125 2967.3±47.4 2701.8±96.2 1147.8±193.72503148.3±224.2 2867.3±30.4 1034.8±99.0500 3392.8±0.0 3040.8±24.0 978.8±4.21000 3519.3±17.7 3192.8±8.5 1150.3±55.94-MU底物溶液用水將4-MU(Sigma公司產品)配成100mM的溶液後，用二乙醇胺(0.7ml/l)和六水合氯化鎂(0.1g/l)組成的緩衝液(10mM，pH＝10.0)稀釋成1mM的4-MU底物溶液。實施例2 FK506的代謝物的測定方法將FK506用大鼠肝微粒體處理時所得代謝物，例如可由DrugMetabolism and Disposition 21(6)，971-977等得知。用代謝物M-II和M-III同實施例一樣進行測定。 M-II M-III結果列於表1表1結果顯示，FK506和M-II的濃度與螢光強度呈對應關係，而M-III濃度和強度值並不對應。實施例3不僅與FKBP-12結合，為了確認能夠測定實際具有免疫作用的FK506及其代謝物的血中濃度，將FK506及其代謝物(M-II、M-III)同FKBP-12的結合活性及免疫抑制活性分別進行如下測定。(1)與FKBP-12的結合活性的測定，同臨床化學38/7，1307-1310(1992)中記錄的測定法相同，利用3H-二氫-FK506、FKBP-12、附著活性炭的右旋糖酐(Dexstran charcoled)等進行。
(2)另外，免疫抑制活性的測定由歐洲專利公報EP-0184162-A267頁中記錄的廣為人知的體外 混合淋巴細胞反應(MLR)試驗進行。結果列於表2表2FKBP結合活性 免疫抑制活性 複合物形成活性(相對值％) (MLP) (相對值％)(相對值％)FK506 100 100 100M-II 14.2 100 79.7M-III 116.00 0表2中的複合物形成活性(％)是由表1的值求得的。
由表2可知，該複合物測量法不能檢測出與FKBP-12有結合活性而無免疫活性的如M-III之類的代謝物(即複合物形成活性(％)為0)，只能檢測象FK506及其代謝物(M-II)那樣具有免疫抑制活性的物質。實施例4環孢菌素A的測定方法(1)代替FKBP-12，將從Sigma公司購買的環啡林與實施例1(1)相同固定於各孔中。(2)然後，將與實施例1(2)相同的牛鈣調神經磷酸酶粗提液，牛鈣調素液及下述的環孢菌素A溶液在各孔中反應，形成複合物。
環孢菌素A溶液環孢菌素A的甲醇溶液(1mg/ml)以與實施例1(1)相同的測定緩衝液適當稀釋。(3)然後與實施例1(3)相同，用不含牛血清白蛋白的測定緩衝液洗滌後，向各孔中加入100μ1以前述分析緩衝液稀釋的、Upstate Biotecnology-公司購買的與鈣調神經磷酸酶(calcineurin)的β亞基相對的小鼠單克隆抗體(α-CN β-MoAb)溶液(1μl/ml)，反應一小時。
然後與實施例1(4)和(5)相同進行螢光分析從而定量測定與環孢菌素A的濃度呈對應關係的所形成的複合物。結果如表3所示。
表3 環孢菌素A的定量測定

使用本發明的定量法，將對鈣調神經磷酸酶有阻斷作用的免疫抑制劑，特別是以FK506為代表的化合物[I]作為治療或預防藥物給藥於有如以下症狀或疾病的患者時，能夠正確地定量測定血中濃度。
心臟、腎臟、肝臟、骨髓、皮膚、角膜、肺、脾臟、小腸、手腳、肌肉、神經、椎間盤、氣管等臟器或組織移植時的排斥反應；骨髓移植引起的移植物對宿主反應；慢性風溼性關節炎；系統性紅斑狼瘡、橋本甲狀腺炎、多發性硬化、重度肌無力、原發性黏膜水腫、自體免疫性萎縮性胃炎、早發閉經、男性不育症、青少年糖尿病、尋常天皰瘡、類天皰瘡、交感性眼炎、水晶性葡萄膜炎、特發性白血球減少、活動性慢性肝炎、特發性肝硬化、圓片狀紅斑性狼瘡、I型糖尿病等自身免疫疾病；及病原性微生物(如煙麴黴、尖孢鐮孢、星形髮癬菌)等引起的感染炎性及增生元進性皮膚病及免疫學的中介皮膚病(如牛皮癬、特異性皮炎、接觸性皮炎、溼疹性皮炎、脂漏性皮炎、扁平苔癬、天皰瘡、水皰瘡類天皰瘡、表皮水皰症、蕁麻疹、血管性水腫、脈管炎、紅斑、皮膚嗜曙紅細增多症、紅斑性狼瘡、痤瘡及圓形脫髮症)；自體免疫病的眼病(如角結膜炎、春季結膜炎、貝切特氏症關聯葡萄膜炎、角膜炎、皰疹性角膜炎、圓椎形角膜炎、角膜上皮營養不良、角膜白斑、眼天皰瘡、負倫氏潰瘍、強膜炎、克雷布氏眼疾、福格特-小抑 原田綜合症、類肉瘤等)可逆的閉塞性氣道疾病(哮喘(如支氣管哮喘、變應性哮喘、內因性哮喘、外因性哮喘及塵埃性哮喘)、特慢性或難愈性哮喘(如遲發性哮喘及氣道反應性元進)及支氣管炎等)；黏膜及血管炎症(如胃潰瘍、缺血及血栓引起的氣管損傷、缺血性腸病、腸炎、壞死性全腸炎、由燒傷引起的腸損傷、白細胞三烯B4-相關症等)；腸炎/變態反應(如腹腔疾病、直腸炎、嗜酸性胃腸炎、細胞肥大症、Crohn′s病及潰瘍性大腸炎)；遠隔胃腸道部位症候性症狀出現食物關聯變態反應疾病(如偏頭痛、鼻炎及溼疹)；腎病(如間質性腎炎、Good pasture′s綜合症、溶血性尿毒綜合症及糖尿病性腎病)；神經性疾病(如多發性肌炎、格一巴二氏綜合症、梅尼埃爾氏病、多發性神經炎、單發性神經炎及神經根病)；內分泌疾病(如甲狀腺功能亢進及巴塞壯氏病)；血液疾病(如巨成紅細胞病、再生不良性貧血、形成不良性貧血、特發性血小板減少性紫斑病、自體免疫性溶血性貧血、粒細胞缺乏症、惡性貧血、巨成紅細胞性貧血及紅細胞缺乏症)；骨疾病(如骨質疏鬆症)；呼吸系統疾病(如類肉瘤病、肺纖維病及特發性間質性肺炎)；
皮膚病(如皮膚肌炎、尋常性白斑病、尋常性魚鱗癬、光線過敏病及皮膚T細胞淋巴瘤)；循環系統病(如動脈硬化、動脈粥樣硬化、大動脈炎綜合症、結節性多發性動脈炎及心肌炎)；膠原病(如硬皮症、韋格納肉芽腫病、肖格倫綜合症)；脂肪過多病；嗜曙紅細胞性肌膜炎；牙周病(如牙齦、牙周、牙槽骨、牙骨質損傷)；腎綜合症(如腎小球性腎炎)；男性型禿髮或老人性禿髮病；肌營養不良；膿皮病及Sézary′s綜合症；阿狄森氏病；染色體異常病(如唐恩綜合症)；活潑氧中介病〔如臟器損傷(保持、移植或缺血性疾病(血栓病、心肌梗塞等)時產生的(心、肝、腎、消化器等的)臟器的缺血性血流損傷)(如血栓形成，心臟梗塞)腸病(如內毒素休克、偽膜性大腸炎、藥物或放射性引起的大腸炎)腎病(如缺血性急性腎功能衰竭、慢性腎功能衰竭)肺病〔如肺內氧或藥物(如對草快(paracort)、博萊黴素)引起的中毒、肺癌、肺氣腫)眼病[如白內障、鐵質沉著、網膜炎、色素沉著病、老年性斑點變質、玻璃體瘢痕、鹼燒傷角膜]皮炎(如多形性紅斑、線狀免疫球蛋白A皮炎、骨質性皮炎)及其它疾病〔如牙齦炎、牙周炎、敗血症、脾炎、或環境汙染(如大氣汙染)、老齡化、致癌物質、癌轉移、高山病等引起的疾病〕〕；游離的組胺及白細胞三烯C4引起的疾病。
權利要求
1.一種測定具有鈣調神經磷酸酶(Calcineurin)抑制活性免疫抑制劑的方法，其中包括形成包含(1)一種免疫親和素(immunophilin)，(2)鈣調神經磷酸酶，(3)鈣調素，(4)鈣離子和(5)一種具有鈣調神經磷酸酶抑制活性的免疫抑制劑的複合物，然後測定該複合物。
2.權利要求1的測定方法，其中的免疫親和素是FKBP-12或環啡林(Cyclophilin)。
3.權利要求2的測定方法，其中免疫親和素是FKBP-12並且具有鈣調神經磷酸酶抑制活性的免疫抑制劑是由下面通式所表示的化合物〔1〕 [I](其中R1是羥基或被保護羥基，R2是氫原子，羥基或被保護的羥基，R3是甲基，乙基，丙基或烯丙基，R4是羥基或甲氧基，R5是氫原子，或R4和R5一起形成氧基，n是一個1或2的整數，含實線或虛線的符號指一個單鍵或一個雙鍵，條件是R4是羥基以及R5是氫原子或當R4和R5一起形成氧基，R2不是被保護的羥基)。
4.權利要求3的測定方法，其中化合物〔1〕是17-烯丙基-1，14-二羥基-12-〔2-(4-羥基-3-甲氧基環己基)-1-甲基乙烯基〕-23，25-二甲氧基-13，19，21，27-四甲基-11，28-二氧雜-4-氮雜三環〔22.3.1.04，9〕二十八碳-18-烯-2，3，10，16-四酮。
5.權利要求2的測定方法，其中的免疫親和素是環啡林並且具有鈣調神經磷酸酶抑制活性的免疫抑制劑是環孢菌素A或其衍生物。
6.權利要求1，2，3，4或5的測定方法，其中的免疫親和素是結合在固相上的。
7.權利要求6的測定方法，其中組成該複合物的鈣調神經磷酸酶是用一種酶免疫測定技術測定的。
8.權利要求7的測定方法，其中鈣調神經磷酸酶的測定是用一種識別鈣調神經磷酸酶的抗鈣調神經磷酸酶的抗體，以及一種識別所述的抗鈣調神經磷酸酶抗體的酶標記的抗IgG抗體進行的。
全文摘要
本發明涉及一種測定具有鈣調神經磷酸酶(Calcineurin)抑制活性的免疫抑制劑的方法及試劑盒，它是通過測定一種含免疫親和素(immunophilin)，鈣調神經磷酸酶，鈣調素，鈣離子以及一種具有鈣調神經磷酸酶抑制活性的免疫抑制劑的複合物來完成的。根據本發明，在測定血液中的具有鈣調神經磷酸酶抑制活性的免疫抑制劑如FK506或環孢菌素A的水平時就有可能更準確的確定具有真正具有免疫抑制劑效果的物質的濃度。
文檔編號G01N33/94GK1147853SQ95192949
公開日1997年4月16日 申請日期1995年3月8日 優先權日1994年3月10日
發明者小林正和, 田村康一 申請人:藤澤藥品工業株式會社