藍莓組織培養方法與流程

2024-03-27 19:59:05 3

本發明涉及組織培養，具體地，涉及藍莓組織培養方法。
背景技術：
：藍莓(Vacciniumspp.)為杜鵑花科越橘屬灌木果樹。藍莓果實被聯合國衛生組織列為最佳營養價值的水果，同時被美國評為世界十大健腦食品，被國際糧農組織列為人類五大健康食品之一。所以藍莓的社會需求量日益增長，各國相繼引種栽培。2009年以來我國藍莓產業出現快速發展，目前主要分布於五大區域：長白山及大小興安嶺地區、遼東半島、膠東半島、長江流域、雲貴川及華南地區。隨著栽培面積和產量的不斷上升，相關應用研究及應用基礎研究越來越受到關注。組織培養在其他園藝作物上開展較多，但在藍莓上的研究較少，藍莓的組織培養不易成功，成活率低。技術實現要素：本發明的目的是提供一種藍莓組織培養方法，解決了用於藍莓組織培養的培養基中激素配比不明確，用於組織培養的單莖段消毒不合理，進而導致藍莓組織成活率低，培養不易成功的問題。為了實現上述目的，本發明提供了一種藍莓組織培養方法，其中，所述藍莓組織培養方法包括：(1)取當年生的藍莓嫩枝條，剪取3-4cm帶芽莖段；(2)將上述帶芽莖段用濃度為70-75體積％的酒精消毒10-30s，再用濃度為0.08-0.12體積％的升汞消毒6-8min，衝洗後備用；(3)將上述帶芽莖段切成1-2cm長的帶芽的單莖段；(4)將上述單莖段的下端插入初代培養基中進行初代培養；其中，所述初代培養基中還含有玉米素和吲哚丁酸，且相對於1L的初代培養基，所述玉米素的含量為0.8-1.2mg，所述吲哚丁酸的含量為0.38-0.42mg；(5)將經過初代培養後的單莖段接種到增殖培養基中進行增殖培養；其中，所述增殖培養基中還含有玉米素和吲哚丁酸，且相對於1L的增殖培養基，所述玉米素的含量為1.4-1.6mg，所述吲哚丁酸的含量為0.08-0.12mg；(6)將經過增殖培養後的單莖段接種到生根培養基中進行生根培養；其中，所述生根培養基中還含有玉米素和吲哚丁酸，且相對於1L的生根培養基，所述玉米素的含量為0-0.1mg，所述吲哚丁酸的含量為0.28-0.32mg；所述初代培養基、增殖培養基、生根培養基為WPM培養基或MS培養基。通過上述技術方案，本發明提供了一種藍莓組織培養方法，其中，所述藍莓組織培養方法包括：取當年生的藍莓嫩枝條，剪取3-4cm帶芽莖段，之後將上述帶芽莖段用濃度為70-80體積％的酒精消毒10-30s，再用濃度為0.08-0.12體積％的升汞消毒6-10min，衝洗後備用；將上述帶芽莖段切成1-2cm長的帶芽的單莖段；將上述單莖段的下端插入初代培養基中進行初代培養，之後再經增殖培養和生根培養；通過明確合理設置初代培養基、增殖培養基和生根培養基中激素的含量，以及對單莖段在接種前進行合理的滅菌處理，使得藍莓的組織培養成活率高，易成功。本發明的其他特徵和優點將在隨後的具體實施方式部分予以詳細說明。具體實施方式以下對本發明的具體實施方式進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的具體實施方式僅用於說明和解釋本發明，並不用於限制本發明。本發明提供了一種藍莓組織培養方法，其中，所述藍莓組織培養方法包括：(1)取當年生的藍莓嫩枝條，剪取3-4cm帶芽莖段；(2)將上述帶芽莖段用濃度為70-75體積％的酒精消毒10-30s，再用濃度為0.08-0.12體積％的升汞消毒6-8min，衝洗後備用；(3)將上述帶芽莖段切成1-2cm長的帶芽的單莖段；(4)將上述單莖段的下端(形態學上的下端)插入初代培養基中進行初代培養；其中，所述初代培養基中還含有玉米素和吲哚丁酸，且相對於1L的初代培養基，所述玉米素的含量為0.8-1.2mg，所述吲哚丁酸的含量為0.38-0.42mg；(5)初代培養後，將經過初代培養後的單莖段接種到增殖培養基中進行增殖培養；其中，所述增殖培養基中還含有玉米素和吲哚丁酸，且相對於1L的增殖培養基，所述玉米素的含量為1.4-1.6mg，所述吲哚丁酸的含量為0.08-0.12mg；(6)增殖培養後，將經過增殖培養後的單莖段接種到生根培養基中進行生根培養；其中，所述生根培養基中還含有玉米素和吲哚丁酸，且相對於1L的生根培養基，所述玉米素的含量為0-0.1mg，所述吲哚丁酸的含量為0.28-0.32mg；所述初代培養基、增殖培養基、生根培養基為WPM培養基或MS培養基。在上述方法中，步驟(1)中帶芽莖段在消毒前可以用少許洗衣粉洗淨後進行流水衝洗，衝洗時間為1h以上，同時，上述操作過程都需要在超淨工作檯上進行，超淨工作檯使用前用75％的酒精棉將超淨工作檯內仔細擦拭一遍，把實驗用到的酒精棉、升汞酒精、解剖刀、鑷子、酒精燈、培養基、無菌水、無菌濾紙等提前放到超淨工作檯上，打開紫外滅菌燈，滅菌30min；同時，增殖和生根的接種過程不需要外植體的滅菌和消毒，直接在無菌的超淨工作檯上接種即可。為了進一步提高組織培養的成活率，所述生根培養基為MS培養基，且所述MS培養基包括有硝酸銨、硝酸鉀、七水硫酸鎂、磷酸二氫鉀和氯化鈣；且相對於1L的生根培養基，所述硝酸銨的含量為14-16g，所述硝酸鉀的含量為18-20g，所述七水硫酸鎂的含量為36-38g，所述磷酸二氫鉀的含量為15-18g，所述氯化鈣的含量為2-3g；同時，在本發明另一種實施方式中，所述生根培養基為WPM培養基，且所述WPM培養基包括有硫酸鉀、七水硫酸鎂、磷酸二氫鉀、硝酸銨和四水硝酸鈣；且相對於1L的WPM培養基，所述硫酸鉀的含量為9-12g，所述七水硫酸鎂的含量為3.6-3.8g，所述磷酸二氫鉀的含量為1.6-1.8g，所述硝酸銨的含量為3.8-4.2g，所述四水硝酸鈣的含量為27-28g。在本發明的一種優選的方法中，為了使得組織培養能獲得充足的光照，合理設置培養條件，所述初代培養、增殖培養和生根培養的培養條件相同，且所述培養條件為：溫度為22-28℃，光照時長為12-16h/d，光照強度為1900-2100lx。在本發明的一種優選的實施方式中，為了提高帶芽莖段的消毒效果，所述藍莓組織培養方法還包括：將步驟(2)中所述帶芽莖段浸泡於70-80體積％的酒精中震蕩消毒10-30s，之後浸泡至0.08-0.12體積％的升汞中震蕩消毒6-10min。在本發明的一種優選的實施方式中，為了防止帶芽莖段受到二次汙染，同時避免帶芽莖段在接種前還殘留升汞和酒精，步驟(2)中所述衝洗採用滅菌水，衝洗次數為5-6次，且每次衝洗時間為4-5min。在本發明的一種優選的實施方式中，為了進一步避免帶芽莖段在接種前還殘留升汞和酒精，步驟(3)中還包括將所述單莖段用無菌濾紙將其表面水分吸乾。優選的，所述初代培養基、增殖培養基和生根培養基中還含有蔗糖和瓊脂，且每種培養基中所述蔗糖的濃度為28-32g/L，所述瓊脂的濃度為6-7g/L。在本發明的一種更為優選的實施方式中，為了防止在接種過程中引入新的汙染細菌，步驟(4)在酒精燈周圍進行。在本發明的一種優選的實施方式中，為了進一步提高組織培養的成活率，所述初代培養的時間為30天以上，所述增殖培養的時間為30天以上。上述方法的具體操作中，所有用到的東西全部都要放到超淨工作檯上紫外滅菌，如果條件允許，打開室內的紫外燈，將白大褂、手套、口罩等一起滅菌，滅菌時，將門窗全部關閉，拉上窗簾。操作過程中，操作人員需戴上口罩、手套，穿好白大褂，關閉超淨工作檯上紫外燈，打開照明燈，把風機調到最大。先用75％的酒精棉把手裡裡外外擦拭乾淨，再把超淨工作檯上重新用75％的酒精棉擦拭乾淨，打開酒精燈，放到工作檯中央，把解剖刀和鑷子在酒精燈上裡裡外外燒三遍，燒紅為準，放入染色缸中備用(剖刀和鑷子必須徹底滅菌，在酒精燈上來回燒，直到燒紅算一次，最少重複三次，同時需要注意的是解剖刀和鑷子要不斷用火燒，必須等到其冷卻後再操作，以防將外植體燙傷)。此外，在上述方法中用到的培養基的配製過程中，瓊脂不容易溶解，需要加熱，加熱時注意不要讓瓊脂沸出來，調節pH時，溫度應控制在50℃以下，溫度過高會影響精確度，同時利用溫度補償。分裝培養基時，可適當加熱後再分裝，邊攪拌邊分裝。在滅菌過程中，採用高溫滅菌方法，滅菌條件為：溫度121℃，壓力131kpa，時間23min。滅菌完成後立即關閉電源，打開放氣按鈕，這樣激素不易失活。滅菌完成後將培養基放置2～3天，確保無菌後方可進行實驗。上述使用的無菌濾紙：是將濾紙放到培養皿中，用報紙或牛皮紙包好再用皮筋捆好，放到滅菌鍋裡一同滅菌，之後備用。上述使用的無菌水：是將蒸餾水放到滅菌鍋裡滅菌即可得到。以下將通過實施例對本發明進行詳細描述。實施例1(1)取當年生的藍莓嫩枝條，剪取3cm帶芽莖段；(2)將上述帶芽莖段用濃度為70體積％的酒精消毒10s，再用濃度為0.08體積％的升汞消毒6min，衝洗後備用；(3)將上述帶芽莖段切成1cm長的帶芽的單莖段；(4)將上述單莖段的下端插入初代培養基(初代培養基為MS培養基)中進行初代培養；其中，所述初代培養基中還含有玉米素和吲哚丁酸，且相對於1L的初代培養基，所述玉米素的含量為0.8mg，所述吲哚丁酸的含量為0.38mg，初代培養基中還加有蔗糖和瓊脂，相對於1L的初代培養基，所述蔗糖的含量為28g，所述瓊脂的含量為6g；(5)將經過初代培養後的單莖段接種到增殖培養基(增殖培養基為MS培養基)中進行增殖培養；其中，所述增殖培養基中還含有玉米素和吲哚丁酸，且相對於1L的增殖培養基，所述玉米素的含量為1.4mg，所述吲哚丁酸的含量為0.08mg，增殖培養基中還加有蔗糖和瓊脂，相對於1L的增殖培養基，所述蔗糖的含量為28g，所述瓊脂的含量為6g；(6)將經過增殖培養後的單莖段接種到生根培養基中進行生根培養(生根培養基為MS培養基)；其中，所述生根培養基中還含有吲哚丁酸，且相對於1L的生根培養基，所述吲哚丁酸的含量為0.28mg，生根培養基中還加有蔗糖和瓊脂，相對於1L的生根培養基，所述蔗糖的含量為28g，所述瓊脂的含量為6g；上述生根培養基中，所述生根培養基為MS培養基，且所述MS培養基包括有硝酸銨、硝酸鉀、七水硫酸鎂、磷酸二氫鉀和氯化鈣；且相對於1L的MS培養基，所述硝酸銨的含量為14g，所述硝酸鉀的含量為18g，所述七水硫酸鎂的含量為36g，所述磷酸二氫鉀的含量為15g，所述氯化鈣的含量為2g。實施例2(1)取當年生的藍莓嫩枝條，剪取4cm帶芽莖段；(2)將上述帶芽莖段用濃度為75體積％的酒精消毒30s，再用濃度為0.12體積％的升汞消毒8min，衝洗後備用；(3)將上述帶芽莖段切成2cm長的帶芽的單莖段；(4)將上述單莖段的下端插入初代培養基(初代培養基為MS培養基)中進行初代培養；其中，所述初代培養基中還含有玉米素和吲哚丁酸，且相對於1L的初代培養基，所述玉米素的含量為1.2mg，所述吲哚丁酸的含量為0.42mg，初代培養基中還加有蔗糖和瓊脂，相對於1L的初代培養基，所述蔗糖的含量為32g，所述瓊脂的含量為7g；(5)將經過初代培養後的單莖段接種到增殖培養基(增殖培養基為MS培養基)中進行增殖培養；其中，所述增殖培養基中還含有玉米素和吲哚丁酸，且相對於1L的增殖培養基，所述玉米素的含量為1.6mg，所述吲哚丁酸的含量為0.12mg，增殖培養基中還加有蔗糖和瓊脂，相對於1L的增殖培養基，所述蔗糖的含量為32g，所述瓊脂的含量為7g；(6)將經過增殖培養後的單莖段接種到生根培養基中進行生根培養(生根培養基為MS培養基)；其中，所述生根培養基中還含有玉米素和吲哚丁酸，且相對於1L的生根培養基，所述玉米素的含量為0.1mg，所述吲哚丁酸的含量為0.32mg，生根培養基中還加有蔗糖和瓊脂，相對於1L的生根培養基，所述蔗糖的含量為32g，所述瓊脂的含量為7g；上述生根培養基中，所述生根培養基為MS培養基，且所述MS培養基包括有硝酸銨、硝酸鉀、七水硫酸鎂、磷酸二氫鉀和氯化鈣；且相對於1L的MS培養基，所述硝酸銨的含量為16g，所述硝酸鉀的含量為20g，所述七水硫酸鎂的含量為38g，所述磷酸二氫鉀的含量為18g，所述氯化鈣的含量為3g。實施例3(1)取當年生的藍莓嫩枝條，剪取4cm帶芽莖段；(2)將上述帶芽莖段用濃度為72體積％的酒精消毒20s，再用濃度為0.1體積％的升汞消毒7min，衝洗後備用；(3)將上述帶芽莖段切成2cm長的帶芽的單莖段；(4)將上述單莖段的下端插入初代培養基(初代培養基為MS培養基)中進行初代培養；其中，所述初代培養基中還含有玉米素和吲哚丁酸，且相對於1L的初代培養基，所述玉米素的含量為1mg，所述吲哚丁酸的含量為0.4mg，初代培養基中還加有蔗糖和瓊脂，相對於1L的初代培養基，所述蔗糖的含量為30g，所述瓊脂的含量為6.5g；(5)將經過初代培養後的單莖段接種到增殖培養基(增殖培養基為MS培養基)中進行增殖培養；其中，所述增殖培養基中還含有玉米素和吲哚丁酸，且相對於1L的增殖培養基，所述玉米素的含量為1.5mg，所述吲哚丁酸的含量為0.1mg，增殖培養基中還加有蔗糖和瓊脂，相對於1L的增殖培養基，所述蔗糖的含量為30g，所述瓊脂的含量為6.5g；(6)將經過增殖培養後的單莖段接種到生根培養基中進行生根培養(生根培養基為MS培養基)；其中，所述生根培養基中還含有玉米素和吲哚丁酸，且相對於1L的生根培養基，所述玉米素的含量為0.05mg，所述吲哚丁酸的含量為0.3mg，生根培養基中還加有蔗糖和瓊脂，相對於1L的生根培養基，所述蔗糖的含量為30g，所述瓊脂的含量為6.5g；上述生根培養基中，所述生根培養基為MS培養基，且所述MS培養基包括有硝酸銨、硝酸鉀、七水硫酸鎂、磷酸二氫鉀和氯化鈣；且相對於1L的生根培養基，所述硝酸銨的含量為15g，所述硝酸鉀的含量為19g，所述七水硫酸鎂的含量為37g，所述磷酸二氫鉀的含量為17g，所述氯化鈣的含量為2.5g。實施例4按照實施例3的方法進行，不同的是，初代培養基、增殖培養基、生根培養基為WPM培養基，其中，生根培養基中包括有硫酸鉀、七水硫酸鎂、磷酸二氫鉀、硝酸銨和四水硝酸鈣；且相對於1L的生根培養基，所述硫酸鉀的含量為10g，所述七水硫酸鎂的含量為3.7g，所述磷酸二氫鉀的含量為1.7g，所述硝酸銨的含量為4g，所述四水硝酸鈣的含量為27.5g。對比例1按照實施例3的方法進行，不同的是，將上述帶芽莖段用濃度為60體積％的酒精消毒5s，再用濃度為0.05體積％的升汞消毒5min，衝洗後備用。對比例2按照實施例3的方法進行，不同的是，將上述帶芽莖段用濃度為90體積％的酒精消毒40s，再用濃度為0.15體積％的升汞消毒12min，衝洗後備用。對比例3按照實施例3的方法進行，不同的是，初代培養基、增殖培養基和生根培養基中不添加玉米素和吲哚丁酸。對比例4按照實施例3的方法進行，不同的是，初代培養基中，相對於1L的初代培養基，所述玉米素的含量為0.5mg，所述吲哚丁酸的含量為0.3mg；生根培養基中，相對於1L的增殖培養基，所述玉米素的含量為1mg，所述吲哚丁酸的含量為0.05mg；在生根培養基中，且相對於1L的生根培養基，所述玉米素的含量為0.1mg，所述吲哚丁酸的含量為0.25mg。對比例5按照實施例3的方法進行，不同的是，初代培養基中，相對於1L的初代培養基，所述玉米素的含量為1.5mg，所述吲哚丁酸的含量為0.45mg；生根培養基中，相對於1L的增殖培養基，所述玉米素的含量為1.8mg，所述吲哚丁酸的含量為0.15mg；在生根培養基中，且相對於1L的生根培養基，所述玉米素的含量為0.12mg，所述吲哚丁酸的含量為0.35mg。表1實施例編號增殖培養20天後單莖段的長勢情況實施例1長勢較好，出現較多的枝葉實施例2長勢較好，出現較多的枝葉實施例3長勢較好，出現較多的枝葉實施例4長勢較好，出現較多的枝葉對比例1長勢較差，出現的枝葉較為稀疏對比例2長勢較差，出現的枝葉較為稀疏對比例3長勢較差，出現的枝葉較為稀疏對比例4長勢較差，出現的枝葉較為稀疏對比例5長勢較差，出現的枝葉較為稀疏通過上述表格可以看出，利用本發明範圍內的方法進行培養，增殖培養20天後，長勢較好，出現較多的枝葉，而利用本發明範圍外的方法進行培養，增殖培養20天後，長勢較差，出現的枝葉較為稀疏，本發明通過明確合理設置初代培養基、增殖培養基和生根培養基中激素的含量，以及對單莖段在接種前進行合理的滅菌處理，使得藍莓的組織培養成活率高，易成功。以上詳細描述了本發明的優選實施方式，但是，本發明並不限於上述實施方式中的具體細節，在本發明的技術構思範圍內，可以對本發明的技術方案進行多種簡單變型，這些簡單變型均屬於本發明的保護範圍。另外需要說明的是，在上述具體實施方式中所描述的各個具體技術特徵，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進行組合，為了避免不必要的重複，本發明對各種可能的組合方式不再另行說明。此外，本發明的各種不同的實施方式之間也可以進行任意組合，只要其不違背本發明的思想，其同樣應當視為本發明所公開的內容。當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp