一種綿羊肺炎支原體低血清高效培養基及其製備方法與流程

2024-03-28 00:09:05 1

技術領域

本發明涉及獸用製劑技術領域，具體涉及一種綿羊肺炎支原體低血清高效培養基及其製備方法。

背景技術：

綿羊肺炎支原體（Mycoplasma ovipneumoniae，Mo）能夠引起綿羊和山羊的間質性肺炎，臨床特徵主要表現為咳嗽、氣喘、流鼻涕、消瘦、貧血、生長發育遲緩等。1963年Mackay等首次從蘇格蘭綿羊病肺中分離出綿羊肺炎支原體。綿羊肺炎支原體主要感染綿羊和山羊，目前在全世界許多國家都有綿羊肺炎支原體引起的綿羊和山羊的發病報導，給世界養羊業造成的巨大經濟損失。1978年我國學者首次在四川省從紐西蘭引進邊區萊斯特種羊的後代羔羊中分離出綿羊肺炎支原體。隨後我國多個省市相繼有山羊和綿羊感染綿羊肺炎支原體發病的報導，該病在我國廣泛流行，成為危害我國養羊業的一種重要病原。

疫苗免疫是預防控制綿羊肺炎支原體感染發生的一個重要手段。目前防控綿羊肺炎支原體感染主要依賴滅活疫苗。培養基是疫苗生產工藝的關鍵。目前綿羊肺炎支原體的培養基主要有改良KM2培養基、改良Thiaucourt's培養基、TSB-1培養基等。現有技術培養基培養綿羊肺炎支原體存在培養時間長、活菌滴度低、繁殖能力差等問題。此外，現有技術培養基中血清含量普遍為20%，高含量血清製備的疫苗無疑增加了異源血清對羊體的過敏應激反應，最終影響疫苗的免疫效果，同時也增加了制苗成本。如果單純降低現有技術培養基中血清含量，會導致培養綿羊支原體抗原滴度低10～100倍左右，既達不到免疫所需抗原劑量，又需提高濃縮倍數，實際增加了生產成本。因此，開發綿羊肺炎支原體低血清高效培養基成為綿羊肺炎支原體疫苗研究和生產中急需解決的重要問題。

技術實現要素：

本發明的目的就是針對上述現有技術中的缺陷，提供了一種綿羊肺炎支原體低血清高效培養基及其製備方法。

為了實現上述目的，本發明提供的技術方案為：一種綿羊肺炎支原體低血清高效培養基，每1000ml低血清高效培養基由基礎培養基和輔助培養基組成；

所述基礎培養基中含有以下組分：

（1）MEM 6.0～7.0 g，

（2）丙酮酸鈉 5.0～6.0 g，

（3）葡萄糖 5.0～6.0 g，

（4）質量濃度為1%的酚紅 2.0～2.5 ml，

（5）Hank’s液 500 ml，

（6）去離子水300 ml；

所述輔助培養基中含有以下組分：

（7）質量濃度為25%的新鮮酵母浸出液 30～50 ml，

（8）質量濃度為3%的L-穀氨醯胺16～17 ml，

（9）質量濃度為10%的L-半胱氨酸4.0～6.0 ml，

（10）質量濃度為15%的水解乳蛋白 32.0～35.0 ml，

（11）10 mg/ml的轉鐵蛋白 0.8～1.5ml，

（12）10 mg/ml的胰島素 0.8～1.5 ml，

（13）2mg/ml的小牛胸腺DNA 8.0～10.0 ml，

（14）20萬IU/ml的青黴素 0.25 ml，

（15）無菌馬血清50 ml。

本發明的第二個目的是提供了上述一種綿羊肺炎支原體低血清高效培養基的製備方法，包括以下步驟：

1）基礎培養基的製備：

取上述的基礎培養基組分中的（1）-（5）逐一加入300ml去離子水（6）中，充分混合，115℃高壓滅菌20min後冷卻至室溫備用；

2）輔助培養基的製備：

取經0.22 微米濾膜濾過除菌的上述的（7）-（15）成分，充分混合，即得輔助培養基；

3）混合定容：

無菌條件下，將步驟1）得到的基礎培養基和步驟2）得到的輔助培養基混合，用滅菌水補齊定容至1000ml，用滅菌的1M NaOH（4 g溶於100 ml去離子水）調pH值到7.2-7.4，充分搖勻，分裝後置4℃保存備用。

本發明的第三個目的是提供了上述一種綿羊肺炎支原體低血清高效培養基在培養綿羊肺炎支原體中的應用。

本發明的第四個目的是提供了上述一種綿羊肺炎支原體低血清高效培養基在製備綿羊肺炎支原體疫苗抗原中的應用。

本發明的有益效果為：本發明的綿羊肺炎支原體低血清高效培養基是根據綿羊肺炎支原體的生長特性，通過對不同的碳源、氮源、蛋白質、無機鹽等諸多營養組分的組合進行了篩選，對培養基的pH值、滲透壓、離子強度等進行比較分析，研究出了適合培養綿羊肺炎支原體的低血清高效培養基。該培養基中MEM和Hank’s液是支原體生長基礎液；培養基中的葡萄糖為綿羊肺炎支原體生長提供碳源和能量；丙酮酸鈉可作為支原體生長的替代碳源；通過添加新鮮酵母浸出液，為綿羊肺炎支原體生長提供所需的氮源、維生素及微量元素等營養成分；添加L-穀氨醯胺可促進微生物代謝、促進蛋白質合成；添加L-半胱氨酸和水解乳蛋白為綿羊肺炎支原體生長提供合適的胺基酸和生長因子；胰島素不僅具有促進糖元與脂肪酸的合成，而且能促進蛋白質、脂類和RNA的合成；轉鐵蛋白是微生物獲取微量元素的重要方式，具有促進胰島素髮揮作用；通過添加馬血清，向綿羊肺炎支原體提供生長所需的膽固醇和必需的飽和或不飽和脂肪酸；通過添加青黴素可抑制雜菌生長，對支原體無抑制效果，可避免培養基汙染和延長培養基保存時間；添加酚紅作為pH值指示劑，可判斷支原體的生長狀況。該培養基的配方中除基本成份外，在培養基中還添加了新鮮酵母浸出液、L-穀氨醯胺、L-半胱氨酸、水解乳蛋白、小牛胸腺DNA、轉鐵蛋白、胰島素等成分，上述成分的添加能明顯提高綿羊肺炎支原體的活菌滴度；經反覆實驗證實，未添加之前活菌滴度為107～108CCU/ml，添加之後活菌滴度可達1010 CCU/ml。而本發明最大的優勢在於培養基中低血清含量和培養綿羊肺炎支原體活菌滴度高。本發明培養基馬血清用量僅為5%，是現有技術培養基血清含量的1/4；用本發明方法製備的綿羊肺炎支原體半成品菌液滴度達1010 CCU/ml，改良KM2培養基培養綿羊肺炎支原體活菌滴度為107CCU/ml，改良Thiaucourt's培養基和TSB-1培養基培養綿羊肺炎支原體活菌滴度為108～109CCU/ml，使用本發明低血清高效培養基的培養綿羊肺炎支原體的活菌滴度明顯高於改良KM2培養基、改良Thiaucourt's培養基和TSB-1培養基。低血清高效培養基大大減輕了疫苗中異源體血清對羊體的過敏應激反應，提高了生物安全；同時培養綿羊肺炎支原體活菌滴度高，降低了疫苗生產成本，為綿羊肺炎支原體優質疫苗的研製奠定了基礎。

附圖說明

圖1顯示為綿羊肺炎支原體在本發明低血清高效培養基的生長情況。

具體實施方式

本發明所用製劑來源：

MEM：GIBCO公司產品，貨號61100-087。

葡萄糖：北京化工廠產品。

丙酮酸鈉：AMRESCO公司產品，貨號為0342。

L-穀氨醯胺：sigma公司產品，貨號為V900419。

L-半胱氨酸：AMRESCO公司產品，貨號為J994。

水解乳蛋白：北京索萊寶科技有限公司產品，貨號為L8100。

轉鐵蛋白：sigma公司產品，貨號為T8158。

胰島素：HUMOBIO公司產品，貨號為HAK4570。

小牛胸腺DNA：sigma公司產品，貨號為D1501。

青黴素：為上海公誼獸藥廠產品。

馬血清：Hyclone公司產品，貨號為SH30074.03。

酚紅：sigma公司產品，貨號為P3532。

質量濃度為1%的酚紅的配製：稱取酚紅1.0 g，置玻璃研缽中，逐滴加入0.1M NaOH（0.4 g溶於10 ml去離子水），研磨至完全溶解。將溶解的酚紅吸入100 ml量瓶中，用去離子水小心洗下研缽中殘留酚紅液至量瓶中，最後補加去離子水至100 ml。

Hank’s 液的配製：稱取5.0 g氯化鈉（NaCl）、0.4 g氯化鉀（KCl）、1.6 g磷酸氫二鈉（Na2HPO4。12H2O）、0.1 g磷酸二氫鉀（KH2PO4)、0.2 g硫酸鎂（MgSO4.7H2O）、10 g葡萄糖，用800 ml去離子水溶解並定容至1000 ml，115℃高壓蒸氣滅菌20分鐘，置4℃保存備用。

質量濃度為25%的新鮮酵母浸出液的製備：取鮮酵母500 g，加入去離子水2000 ml中，攪拌溶解，用濃鹽酸：去離子水以=1:1（體積比）調pH值至4.5-5.0，80℃水浴（瓶內溫度）30分鐘，3000 轉/分離心20分鐘，取上清液。將上清液用1 M NaOH（4 g溶於100 ml去離子水）調pH值至7.8-8.0，煮沸，置室溫放涼後用雙層濾紙過濾，再補去離子水至2000 ml，-20℃保存備用。

實施例1：

1、本發明培養基的製備：

基礎培養基：

（1）MEM 6.5 g

（2）丙酮酸鈉 6.0 g

（3）葡萄糖 6.0 g

（4）質量濃度為1%的酚紅 2.5 ml

（5）Hank’s液 500 ml

（6）去離子水300 ml。

輔助培養基：

（7）質量濃度為25%的新鮮酵母浸出液 30 ml

（8）質量濃度為3%的L-穀氨醯胺16 ml

（9）質量濃度為10%的L-半胱氨酸5.0 ml

（10）質量濃度為15%水解乳蛋白 32.5 ml

（11）轉鐵蛋白（10 mg/ml）1.0 ml

（12）胰島素（10 mg/ml）1.0 ml

（13）小牛胸腺DNA （2mg/ml） 10.0 ml

（14）青黴素 (20萬IU/ml) 0.25 ml

（15）無菌馬血清50 ml

將基礎培養基中（1）-（5）成分逐一溶入300ml去離子水（6）中，115℃高壓滅菌20min。待冷卻至室溫後，在無菌條件下加入經0.22 微米濾膜濾過除菌的輔助培養基（7）-（15）成分，混合，用滅菌水補齊定容至1000ml，用滅菌的1M NaOH調pH值到7.4，充分搖勻後分裝，置4℃保存備用。

實施例2：

本發明培養基的製備：

基礎培養基：

（1）MEM 6.0 g

（2）丙酮酸鈉 6.0 g

（3）葡萄糖 6.0 g

（4）質量濃度為1%的酚紅 2.5 ml

（5）Hank’s液 500 ml

（6）去離子水300 ml。

輔助培養基：

（7）質量濃度為25%的新鮮酵母浸出液 35 ml

（8）質量濃度為3%的L-穀氨醯胺17 ml

（9）質量濃度為10%的L-半胱氨酸5.0 ml

（10）質量濃度為15%的水解乳蛋白 35.0 ml

（11）轉鐵蛋白（10 mg/ml）1.0 ml

（12）胰島素（10 mg/ml）0.8 ml

（13）小牛胸腺DNA （2mg/ml） 10.0 ml

（14）青黴素 (20萬IU/ml) 0.25 ml

（15）無菌馬血清50 ml

將基礎培養基中（1）-（5）成分逐一溶入300ml去離子水（6）中，115℃高壓滅菌20min。待冷卻至室溫後，在無菌條件下加入經0.22 微米濾膜濾過除菌的輔助培養基（7）-（15）成分，混合，用滅菌水補齊定容至1000ml，用滅菌的1M NaOH調pH值到7.4，充分搖勻後分裝，置4℃保存備用。

實施例3：

應用本發明培養基、改良KM2培養基、改良Thiaucourt's培養基、TSB-1培養基對綿羊肺炎支原體Y98株進行比較試驗：

1、本發明培養基的製備

基礎液：

（1）MEM 6.0 g

（2）丙酮酸鈉 5.0 g

（3）葡萄糖 6.0 g

（4）質量濃度為1%的酚紅 2.5 ml

（5）Hank’s 液 500 ml

（6）去離子水300 ml。

輔助培養基：

（7）質量濃度為25%的新鮮酵母浸出液 30 ml

（8）質量濃度為3%的L-穀氨醯胺16.7 ml

（9）質量濃度為10%的L-半胱氨酸5.0 ml

（10）質量濃度為15%的水解乳蛋白 33.4 ml

（11）轉鐵蛋白（10 mg/ml）1.0 ml

（12）胰島素（10 mg/ml）1.0 ml

（13）小牛胸腺DNA （2mg/ml） 10.0 ml

（14）青黴素 (20萬IU/ml) 0.25 ml

（15）無菌馬血清50 ml

將基礎培養基中（1）-（5）成分逐一溶入300ml去離子水（6）中，115℃高壓滅菌20min。待冷卻至室溫後，在無菌條件下加入經0.22 微米濾膜濾過除菌的輔助培養基（7）-（15）成分，混合，用滅菌水補齊定容至1000ml，用滅菌的1M NaOH調pH值到7.4，充分搖勻後分裝，置4℃保存備用。

2、改良Thiaucourt's培養基的製備（1000ml）

基礎液：

PPLO肉湯21.0 g

去離子水700 ml。

115℃高壓滅菌20 min；

培養基：

基礎液 700ml

50%丙酮酸鈉4.0 ml

50%葡萄糖2.0 ml

質量濃度為1%的酚紅2.5 ml

質量濃度為25%的新鮮酵母浸出液100 ml

青黴素（20萬IU/ml）1.0 ml

10%醋酸鉈1.0 ml

無菌馬血清200 ml

混合用滅菌的1M NaOH調pH值到7.4，經0.22 微米濾膜濾過除菌分裝備用。

3、TSB-1培養基（1000ml）

胰蛋白腖大豆肉湯 30g

乳糖 10 g

DNA 0.02g

質量濃度為1%的酚紅2.5 ml

青黴素（20萬IU/ml）1.0 ml

10%醋酸鉈1.0 ml

無菌豬血清200 ml

用去離子水定容至1000ml，用滅菌的1M NaOH調pH值到7.4，經0.22 微米濾膜濾過除菌分裝備用。

4、改良KM2培養基（500ml）

1.7%水解乳蛋白Hank’s液150 ml

MEM 2.5 g

葡萄糖2.0 g

丙酮酸鈉1.0 g

質量濃度為1%的酚紅1.25 ml

質量濃度為25%的新鮮酵母浸出液10 ml

青黴素（20萬IU/ml）0.5 ml

10%醋酸鉈0.5 ml

無菌馬血清100 ml

用去離子水定容至500ml，用滅菌的1M NaOH調pH值到7.4，經0.22 微米濾膜濾過除菌分裝備用。

5、綿羊肺炎支原體的培養 將綿羊肺炎支原體Y98株（購自中國獸醫微生物菌種保藏中心CVCC，編號CVCC384）分別接種本發明低血清高效培養基（血清含量為5%）、改良KM2培養基（血清含量為20%）、改良Thiaucourt's培養基（血清含量為20%）、TSB-1培養基（血清含量為20%），種子繼代復壯後，分別按10% (V/V) 的比例接種對應培養基，37℃恆溫培養，當培養基的顏色變黃、pH值由7.4降至6.5～6.8時，無菌取出培養物。

6、活菌滴度（CCU）測定。方法如下：取12支試管，每管加對應培養基4.5 ml，在第1管中加入0.5 ml生長良好的綿羊肺炎支原體培養物，用振蕩器充分混勻，換新的移液管，從第1管吸取0.5 ml加入到第2管中，依次進行10倍稀釋至第11管，第11管中棄去0.5 ml培養液；得到培養液的稀釋度分別為10-1-10-11，第12管為對應培養基對照。試驗管設3個重複。將試管置37℃恆溫培養箱中靜置培養，每天觀察顏色變化，連續觀察10天，發生顏色變化的最高稀釋度即為該培養物的活菌滴度，用顏色變化單位（CCU）表示。試驗重複3次。

7、結果：

綿羊肺炎支原體接種4種培養基3次生長試驗CCU測定結果見表1。

表1

3次試驗結果顯示，在同樣條件下，使用改良KM2培養基、改良Thiaucourt's培養基、TSB-1培養基培養綿羊肺炎支原體的生長時間均為48h，本發明培養基的生長時間為24h，比現有技術培養時間縮短了1/2。使用改良KM2培養基培養綿羊肺炎支原體3次CCU測定結果均為107CCU/ml，改良Thiaucourt's培養基培養綿羊肺炎支原體3次CCU測定結果為108～109 CCU/ml，TSB-1培養基培養綿羊肺炎支原體的3次CCU測定結果為108 ～109CCU/ml；本發明低血清高效培養基培養綿羊肺炎支原體，生長情況見圖1。本發明培養基培養綿羊肺炎支原體3次CCU測定結果均為1010 CCU/ml。結果表明，同樣條件下，使用本發明低血清高效培養基的活菌滴度遠遠高於改良KM2培養基，顯著高於改良Thiaucourt's培養基和TSB-1培養基。以上結果說明，本發明的綿羊肺炎支原體培養基具有血清含量低、生長迅速和活菌滴度高的特點。

最後應說明的是：以上所述僅為本發明的優選實施例而已，並不用於限制本發明，儘管參照前述實施例對本發明進行了詳細的說明，對於本領域的技術人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特徵進行等同替換。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。