飽和脂肪鏈胺Glu-Asp-Gly三肽醯胺及其合成方法和應用的製作方法

2024-03-05 04:42:15 2

專利名稱：飽和脂肪鏈胺Glu-Asp-Gly三肽醯胺及其合成方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及飽和脂肪鏈胺三肽醯胺，尤其涉及一系列具有免疫抑制活性的飽和脂 肪鏈胺GlU-Asp-Gly三肽醯胺，還涉及這些飽和脂肪鏈胺三肽醯胺的製備方法以及它們作 為免疫抑制劑的應用，屬於生物醫藥領域。
背景技術：
據統計，截至2002年底，全球共進行各種器官移植935792例次，其中腎移植 585877例次、肝臟移植112153例次、心臟移植66559例次。此外，胰、肺、小腸等器官移植 及心_肺、胰-腎、肝-腎、肝-腸等多臟器聯合移植也都獲得成功並應用於臨床。目前，腎 移植1年人/腎存活率達90 % 95 %，5年存活率超過70 %。臟器移植要形成移植耐受， 這就要求患者終身服用免疫抑制劑。器官移植的進展在很大程度上取決於免疫抑制劑的進 展。近幾十年，雖然新免疫抑制藥物使得器官移植在臨床取突飛猛進發展，但它們的毒副作 用，例如腎毒性和骨髓抑制作用仍然是器官移植造必須面對的嚴重問題。環孢菌素A是目前臨床常用的免疫抑制劑。由於環孢菌素A的水溶性極差以及腎 毒性很強，所以無論是劑型還是療效都不盡人意。提高環孢菌素A製劑的水溶性，降低環孢 菌素A的腎毒性，一直是環孢菌素A研究的熱點。尿毒素肽具有免疫抑制活性。發明人認 識到，把尿毒素肽與脂肪鏈胺綴合生成的醯胺具有自組裝性能，因而可以用作具有免疫抑 制活性的載藥材料。例如可以用來包裹環孢菌素A，達到提高環孢菌素A的水溶性和降低環 孢菌素A腎毒性的雙重目的。

發明內容
本發明的目的之一是，將尿毒素三肽與脂肪鏈胺綴合，得到具有免疫抑制活性的 飽和脂肪鏈胺三肽醯胺綴合物。本發明的目的之一是通過以下技術方案實現的通式I的6種具有免疫抑制活性的飽和脂肪鏈胺Glu-Asp-Gly三肽醯胺Glu-Asp-Gly-NH-CH2- (CH2) nCH3 I其中，通式I 中的 η = 6、8、10、12、14 或 16。本發明的目的之二是，提供一種製備上述具有免疫抑制活性的飽和脂肪鏈胺 Glu-Asp-Gly三肽醯胺的方法。本發明的目的之二是通過以下技術方案來實現的 一種製備通式I的6種具有免疫抑制活性的飽和脂肪鏈胺Glu-Asp-Gly三肽醯胺 的方法，該方法包括(1)將N端保護基保護的甘氨酸與飽和脂肪胺縮合，所述飽和脂肪胺為CH3(CH2) nCH2NH2, η = 6、8、10、12、14 或 16 ；(2)脫去N端保護基得到飽和脂肪胺甘氨酸醯胺；(3)按照現有液相合成技術，將飽和脂肪胺甘氨酸醯胺與天冬氨酸的保護中間體、穀氨酸的保護中間體逐步接肽合成保護基保護的飽和脂肪胺三肽綴合物；(4)依次脫去保護基保護的飽和脂肪胺三肽綴合物的N端保護基和C端保護基得 到目標化合物。其中所述N端保護基是對多肽的N端進行保護時常用的保護基團，例如可以是叔 丁氧羰基(Boc)；所述C端保護基是對多肽的C端進行保護時常用的保護基團，例如可以是 苄氧基(OBzl)；所述液相合成技術及所述保護、縮合、脫保護的過程是本領域的常規並公 知的技術。該製備方法可以用圖1的路線概括，具體的，所述方法包括(1)在(Boc)2O和NaOH存在下將甘氨酸轉化為N-叔丁氧羰基甘氨酸；(2)在DCC、HOBt、無水THF存在下將N-叔丁氧羰基甘氨酸與飽和脂肪胺縮合，生 成飽和脂肪胺N-叔丁氧羰基甘氨酸醯胺；(3)在氯化氫-乙酸乙酯中將飽和脂肪胺N-叔丁氧羰基甘氨酸醯胺脫除叔丁氧羰 保護基，生成飽和脂肪胺甘氨酸醯胺；(4)在無水THF中，在DCC和HOBt存在下將飽和脂肪胺甘氨酸醯胺與N-叔丁氧 羰基-β -苄酯天冬氨酸縮合，生成飽和脂肪胺N-叔丁氧羰基_ β _苄酯天冬氨醯甘氨酸醯 胺；(5)在氯化氫_乙酸乙酯存在下將飽和脂肪胺N-叔丁氧羰基_ β _苄酯天冬氨醯 甘氨酸醯胺脫除叔丁氧羰基，生成飽和脂肪胺β _苄酯-天冬氨醯甘氨酸醯胺；(6)在無水THF中，在DCC和HOBt存在下將飽和脂肪胺β -苄酯天冬氨醯甘氨酸 醯胺與N-叔丁氧羰基_ Y _苄酯穀氨酸縮合，生成飽和脂肪胺N-叔丁氧羰基_ Y _苄酯谷 氨醯-β -苄酯天冬氨醯甘氨酸醯胺；(7)在氯化氫_乙酸乙酯中將飽和脂肪胺N-叔丁氧羰基_ Y _苄酯穀氨醯β _苄 酯天冬氨醯甘氨酸醯胺脫除叔丁氧羰基，生成飽和脂肪胺Y-苄酯穀氨醯苄酯天冬氨 醯甘氨酸醯胺；(8)在無水乙醇中，在Pd/C存在下將飽和脂肪胺Y-苄酯穀氨醯-β-苄酯天冬氨 醯甘氨酸醯胺氫解，生成飽和脂肪胺穀氨醯天冬氨醯甘氨酸醯胺。實驗結果表明本發明的6種具有免疫抑制活性的飽和脂肪鏈胺Glu-Asp-Gly三肽 醯胺具有優秀的免疫抑制作用，臨床上可作為免疫抑制劑應用。並且本發明的飽和脂肪鏈 胺Glu-Asp-Gly三肽醯胺水溶液中均能自組裝成粒經穩定在38. 9-1030nm的納米球，可作 為製備微乳或脂質體藥物載體的製劑材料，另外可作為製備微乳、脂質體藥物載體的靶向 製劑材料。


圖1為通式I的6種具有免疫抑制活性的飽和脂肪鏈胺Glu-Asp-Gly三肽醯胺的 合成路線。i)無水THF、DCC、HOBt和NMM ；ii)4N氯化氫-乙酸乙酯溶液；iii)無水乙醇、 Pd/C 和 H2 ；7a η = 6,7b η = 8,7c η = 10，7d η = 12，7e η = 14，7f η = 16。為了進一步闡述本發明，下面給出一系列實施例。這些實施例完全是例證性的，它 們僅用來對本發明進行具體描述，不應當理解為對本發明的限制。
4/9頁
具體實施例方式實施例IBoc-Gly-NHCH2 (CH2) 6CH3 的製備將0. 80g (4. 57mmol) Boc-Gly溶於20ml無水THF，冰浴下往得到的溶液中 加入0. 62g(4. 57mmol)N-羥基苯並三氮唑(HOBt)，並使完全溶解。10分鐘後加入 1. 13g(5. 48mmol) 二環己基羰二亞胺(DCC)，得到反應液(I)。冰浴下把0. 72g(4. 57mmol) 脂肪胺CH3(CH2)6CH2NH2懸浮於20ml無水THF中，然後加入Iml N-甲基嗎啉(NMM)，調pH 8-9。攪拌35分鐘，得到反應液(II)。冰浴下把反應液⑴加入反應液(II)中，先冰浴下攪 拌lh，再室溫攪拌12h，TLC (氯仿/甲醇，10 1)顯示Boc-Lys (Z)消失。濾除二環己基脲 (D⑶)，減壓除去THF。殘留物用50ml乙酸乙酯溶解。得到的溶液依次用飽和NaHCO3水溶 液洗、飽和NaCl水溶液洗、5% KHSO4水溶液洗和飽和NaCl水溶液洗。有機相用無水Na2SO4 乾燥、過濾、濾液減壓濃縮至幹，得到1. 24g(95% )標題化合物，為無色油狀物。ESI-MS(m/ ζ) :287[M+H]+。實施例 2Boc-Gly-NHCH2 (CH2) 8CH3 的製備按照實施例1 的方法由 0. 80g (4. 57mmol) Boc-Gly 和 0. 72g(4. 57mmol) CH3(CH2)8CH2NH2 製得 1. 35g(94% )標題化合物，為無色固體。ESI-MS(m/z) :315[M+H] +。實施例3Boc-Gly-NHCH2 (CH2) 10CH3 的製備按照實施例1 的方法由 0. 80g (4. 57mmol) Boc-Gly 和 0. 85g(4. 57mmol) CH3(CH2)ltlCH2NH2 製得 1. 47g(94% )標題化合物，為無色固體。ESI-MS(m/z) :343[M+H] +。實施例4Boc-Gly_NHCH2 (CH2) 12CH3 的製備按照實施例1 的方法由 0. 80g (4. 57mmol) Boc-Gly 和 0. 98g(4. 57mmol) CH3(CH2)12CH2NH2 製得 1. 6Ig(95% )標題化合物，為無色固體。ESI-MS (m/z) :371[M+H] +。實施例5Boc-Gly-NHCH2 (CH2) 14CH3 的製備按照實施例1 的方法由 0. 80g (4. 57mmol) Boc-Gly 和 1. IOg (4. 57mmol) CH3(CH2) I4CH2NH2 製得 1. 76g(97% )標題化合物，為無色固體。ESI-MS(m/z) :399[M+H] +。實施例6Boc-Gly-NHCH2 (CH2) 16CH3 的製備按照實施例1 的方法由 0. 80g (4. 57mmol) Boc-Gly 和 1. 23g(4. 57mmol) CH3(CH2)16CH2NH2 製得 1. 75g(90% )標題化合物，為無色固體。ESI-MS(m/z) :427[M+H] +。
實施例 7HC1 · Gly-NHCH2 (CH2) 6CH3 的製備將1. 24g (4. 33mmol) Boc-Gly-OCH2 (CH2) 6CH3 溶解在 80ml 4N 氯化氫-乙酸乙酯溶 液中，室溫攪拌2小時，TLC (氯仿甲醇，5 1)顯示Boc-Gly-OCH2 (CH2) 6CH3消失，減壓濃 縮除去乙酸乙酯，殘留物反覆加少量乙醚進行減壓濃縮以除去氯化氫。最後加少量乙醚將 殘留物研磨成0.92g(95% )標題化合物，為米黃色油狀物。ESI-MS(m/z) :187[M+H] +。實施例8HC1 · Gly-NHCH2 (CH2) 8CH3 的製備按照實施例7 的方法，從 1. 35g(4. 29mmol) Boc-Gly-NHCH2 (CH2) 8CH3 製得 1.03g(96% )標題化合物，為米黃色油狀物。ESI-MS(m/z) :215[M+H] +。實施例9HC1 · Gly-NHCH2 (CH2) 10CH3 的製備按照實施例7 的方法，從 1. 47g(4. 29mmol) Boc-Gly-NHCH2 (CH2) 10CH3 製得 1. 15g(96% )標題化合物，為米黃色油狀物。ESI-MS(m/z) :243[M+H] +。實施例IOHCl · Gly-NHCH2 (CH2) 12CH3 的製備
按照實施例7 的方法，從 1. 61g(4. 35mmol)Boc-Gly-NHCH2(CH2) 12CH3 製得 1. 31g(98% )標題化合物，為米黃色固體。ESI-MS(m/z) :271[M+H] +。實施例1 IHCl · Gly-NHCH2 (CH2) 14CH3 的製備按照實施例7 的方法，從 1. 76g(4. 42mmol) Boc-Gly-NHCH2 (CH2) 14CH3 製得 1. 35g(91% )標題化合物，為米黃色固體。ESI-MS(m/z) :299[M+H] +。實施例 12HC1 · Gly-NHCH2 (CH2) 16CH3 的製備按照實施例7 的方法，從 1. 75g(4. 11 匪ol) Boc-Gly-NHCH2 (CH2) 16CH3 製得 1.40g(94% )標題化合物，為米黃色固體。ESI-MS(m/z) :327[M+H] +。實施例I3Boc-Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 6CH3 的製備按照實施例1 的方法由 1.33g(4. 13mmol) Boc-Asp (OBzl)和 0.92g(4. 13mmol) HCl · Gly-NHCH2(CH2)6CH3 製得 1.93g(95% )標題化合物，為淡黃色油狀物。ESI-MS(m/z) 492 [M+H]+，[a J20d = -15. 2 (c = 1. 0，CH3OH)。實施例14Boc-Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 8CH3 的製備按照實施例1 的方法由 1. 33g(4. llmmol) Boc-Asp (OBzl)和 1. 03g(4. llmmol) HCl · Gly-NHCH2(CH2)8CH3 製得 1.94g(91% )標題化合物，為淡黃色油狀物。ESI-MS(m/z) 520 [M+H]+，[a J20d = -16. 2 (c = 1. 0，CH3OH)。實施例I5Boc-Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 10CH3 的製備按照實施例1 的方法由 1. 33g(4. 13mmol) Boc-Asp (OBzl)和 1. 15g(4. 13mmol) HCl · Gly-NHCH2(CH2)ltlCH3 製得 2. 17g(96% )標題化合物，為無色油狀物。ESI-MS(m/z) 548 [Μ+Η]+, [α ]20d = -15. 8 (c = 1. O, CH3OH)。實施例I6Boc-Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 12CH3 的製備按照實施例1 的方法由 1. 38g(4. 27mmol) Boc-Asp (OBzl)和 1. 31g(4. 27mmol) HCl .Gly-NHCH2 (CH2)12CH3 製得 2.09g (85% )標題化合物，為淡黃色油狀物。ESI-MS (m/z) 576[M+H]+，[a J20d = -14. 1 (c = 1. 0，CH3OH)。實施例I7Boc-Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 14CH3 的製備按照實施例1 的方法由 1. 31g (4. 04mmol) Boc-Asp (OBzl)和 1. 35g(4. 04mmol) HCl · Gly-HNCH2(CH2)14CH3 製得 2. 17g(89% )標題化合物，為淡黃色固體。ESI-MS (m/z) 604[Μ+Η]+, [α ]20d = -5. 4(c = 1. O, CH3OH)。實施例I8Boc-Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 16CH3 的製備按照實施例1 的方法由 1. 25g (3. 86mmol) Boc-Asp (OBzl)和 1. 40g(3. 86mmol) HCl · Gly-NHCH2(CH2)16CH3 製得 2. 09g(86% )標題化合物，為淡黃色固體。ESI-MS (m/z) 632[M+H]+，[a ]20d = -1. 3(c = 1. 0，CH3OH)。實施例I9HCl · Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 6CH3 的製備按照實施例7 的方法，從 1. 93g (3. 93mmol) Boc-Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 6CH3 制 得 1.68g(91% )標題化合物，為米黃色固體。ESI-MS (m/z) 392 [Μ+Η]+, [ α J20d = 4. O (c = 1. O, CH3OH)。實施例2OHCl · Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 8CH3 的製備按照實施例7 的方法，從 1. 94g (3. 74mmol) Boc-Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 8CH3 制 得 1. 64g(96% )標題化合物，為米黃色固體。ESI-MS (m/z) 420 [Μ+Η]+, [ α J20d = 2. 8 (c =
61. 0，CH3OH)。實施例2IHCl · Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 10CH3 的製備按照實施例7 的方法，從 2. 17g (3. 97mmol) Boc-Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 10CH3 制 得 1. 77g(92% )標題化合物，為米黃色固體。ESI-MS (m/z) 448 [Μ+Η]+, [ α J20d = 15. 8 (c = 1· 0，CH3OH)。實施例22HCl · Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 12CH3 的製備按照實施例7 的方法，從 2. 09g (3. 63mmol) Boc-Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 12CH3 制 得 1. 76g(94% )標題化合物，為米黃色固體。ESI-MS(m/z) 476 [Μ+Η]+, [ α J20d = 2. 8 (c = 1. O, CH3OH)。實施例23HCl · Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 14CH3 的製備按照實施例7 的方法，從 2. 17g (3. 60mmol) Boc-Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 14CH3 制 得 185g(95% )標題化合物，為米黃色固體。ESI-MS(m/z) :504[Μ+Η]+，[α ]20D = 3. O (c = 1. O, CH3OH)。實施例24HC1 · Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 16CH3 的製備按照實施例7 的方法，從 2. 09g (3. 31mmol) Boc-Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 16CH3 制 得 1. 82g(97% )標題化合物，為米黃色固體。ESI-MS(m/z) 532[Μ+Η]+, [ α J20d = 2. 4(c = 1. O, CH3OH)。實施例25Boc-Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 6CH3 的製備按照實施例1 的方法由 1. 32g(3. 93mmol)Boc-Glu(OBzl)和 1. 68g(3. 93mmol) HCl · Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 6CH3製得，所得化合物經矽膠柱層析純化得無色透明油狀 物 1.90g，純化條件氯仿甲醇=100 1，收率為 68%。ESI-MS (m/z) 711 [Μ+Η]+, [ α J20d =-19. l(c = 1. 0，CH3OH)。實施例26Boc-Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 8CH3 的製備按照實施例1 的方法由 1. 21g(3. 60mmol)Boc-Glu(OBzl)禾Π 1. 64g(3. 60mmol) HCl · Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 8CH3製得，所得化合物經矽膠柱層析純化得無色透明油狀 物 1.81g，純化條件氯仿甲醇=100 1，收率為 68%。ESI-MS (m/z) 739 [Μ+Η]+, [ α J20d =-36. 4 (c = 1. 0，CH3OH)。實施例27Boc-Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 10CH3 的製備按照實施例1 的方法由 1. 23g(3. 66mmol)Boc-Glu(OBzl)和 1. 77g(3. 66mmol)HC 1 · Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 10CH3製得，所得化合物經矽膠柱層析純化得無色透明油狀物 1. 71g，純化條件氯仿甲醇=100 1，收率為 61%。ESI-MS(m/z) :767[Μ+Η]+，[α ]20D =-24. 6 (c = 1. 0，CH3OH)。實施例28Boc-Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 12CH3 的製備按照實施例1 的方法由 1. 16g(3. 44mmol)Boc-Glu(OBzl)禾Π 1. 76g(3. 44mmol)HC 1 · Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 12CH3製得，所得化合物經矽膠柱層析純化得無色透明油狀物 1. 78g，純化條件氯仿甲醇=100 1，收率為 65%。ESI-MS(m/z) :795[Μ+Η]+，[α ]20D =-31. 8 (c = 1. 0，CH3OH)。實施例29Boc-Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 14CH3 的製備按照實施例1 的方法由 1. 16g(3. 43mmol)Boc-Glu(OBzl)和 1. 85g(3. 43mmol)HC
71 · Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 14CH3製得，所得化合物經矽膠柱層析純化得無色透明油狀物 2. 00g，純化條件氯仿甲醇=100 1，收率為 71%。ESI-MS(m/z) :823[Μ+Η]+，[α ]20D =-13. 4 (c = 1. 0，CH3OH)。實施例3OBoc-Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 16CH3 的製備按照實施例1 的方法由 1. 08g(3. 21mmol)Boc-Glu(OBzl)和 1. 82g(3. 21mmol)HC 1 · Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 16CH3製得，所得化合物經矽膠柱層析純化得無色透明油狀物 1.88g，純化條件氯仿甲醇=100 1，收率為 69%。ESI-MS(m/z) :851[Μ+Η]+，[α ]20D =-3. 0(c = 1. 0，CH3OH)。實施例31HC1 · Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 6CH3 的製備按照實施例7 的方法，從 1. 51g(2. 13mmol)Boc-Glu (OBzl)-Asp (OBzl)-Gly-NHCH2 (CH2)6CH3 製得 1. 28g(93% )標題化合物，為無色固體。ESI-MS (m/z) :611[M+H] +。實施例32HC1 · Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 8CH3 的製備按照實施例7 的方法，從 1. 41mg(l. 91mmol)Boc-Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-NHCH 2(CH2)8CH3 1. 16g(90% )標題化合物，為無色固體。ESI-MS(m/z) :641[M+H]+。實施例33HC1 · Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 10CH3 的製備按照實施例7 的方法，從 1. 60mg(2. 09mmol) Boc-Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-NHCH 2(CH2)ltlCH3 製得 1. 36g(93% )標題化合物，為無色固體。ESI_MS(m/z) :669[M+H] +。實施例34HC1 · Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 12CH3 的製備按照實施例7 的方法，從 1. 52mg(l. 91mmol) Boc-Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-NHCH 2(CH2)12CH3 製得 1. 20g(86% )標題化合物，為無色固體。ESI_MS(m/z) :697[M+H] +。實施例35HC1 · Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 14CH3 的製備按照實施例7 的方法，從 1. 65g(2. Olmmol) Boc-Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2)14CH3 製得 1. 37g(90% )標題化合物，為無色固體。ESI-MS(m/z) :725[M+H]+。實施例36HC1 · Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 16CH3 的製備按照實施例7 的方法，從 1. 56g(l. 84mmol)Boc-Glu (OBzl)-Asp (OBzl)-Gly-NHCH2 (CH2)16CH3 製得 1. 27g(88% )標題化合物，為無色固體。ESI-MS(m/z) :751[M+H]+。實施例 37Glu-Asp-Gly-NHCH2 (CH2) 6CH3 (7a)的製備將1. 28g(l. 98mmol)HCl .Glu (OBzl)-Asp (OBzl)-Gly-NHCH2 (CH2)6CH3 用乙醇溶解、 加入適量Pd/C(約5% )、通H2(0. 02Mba)，室溫攪拌至原料點消失。濾除Pd/C、濾液減壓 濃縮至幹。製得751mg(82% )標題化合物，為無色固體。ESI_MS(m/Z) :429[Μ_ΗΓ，[a]20D =-9. 6 (c = 1. 0，CH3OH)，Μ. p. 104. 7—106. 4°C。實施例38Glu-Asp-Gly_NHCH2 (CH2) 8CH3 (7b)的製備將1. 08g(l. 60mmol)HCl .Glu (OBzl)-Asp (OBzl)-Gly-NHCH2 (CH2)8CH3 用乙醇溶解、 加入適量Pd/C(約5% )、通H2(0. 02Mba)，室溫攪拌至原料點消失。濾除Pd/C、濾液減壓 濃縮至幹。製得699mg(80% )標題化合物，為無色固體。ESI_MS(m/Z) :457[Μ_ΗΓ，[a]20D =-6. l(c = 1. 0，CH3OH)，Μ. ρ. :89· 7-90. 1°C。實施例39Glu-Asp-Gly_NHCH2 (CH2) 10CH3 (7c)的製備將1. OOmg(1. 44mmol)HCl · Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 10CH3 用乙醇溶 解、加入適量Pd/C(約5% )、通H2(0. 02Mba)，室溫攪拌至原料點消失。濾除Pd/C、濾液減壓
8濃縮至幹。製得853mg(84% )標題化合物，為無色固體。ESI_MS(m/Z) :485[Μ_ΗΓ，[a]20D =-5. 5(c = 1. 0，CH3OH)，Μ. ρ. :87· 4-89. 1°C。實施例40Glu-Asp-Gly_NHCH2 (CH2) 12CH3 (7d)的製備將1. 30g(l. 78mmol)HCl · Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 12CH3 用乙醇溶 解、加入適量Pd/C(約5% )、通H2(0. 02Mba)，室溫攪拌至原料點消失。濾除Pd/C、濾液減壓 濃縮至幹。製得844mg(86% )標題化合物，為無色固體。ESI_MS(m/Z) :513[Μ_ΗΓ，[a]20D =-2· 8 (c = 1· 0，CH3OH)，Μ. ρ. :84· 7-85. 7°C。實施例41Glu-Asp-Gly_NHCH2 (CH2) 14CH3 (7e)的製備將1. 26g(l. 66mmol)HCl · Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 14CH3 用乙醇溶 解、加入適量Pd/C(約5% )、通H2(0. 02Mba)，室溫攪拌至原料點消失。濾除Pd/C、濾液減壓 濃縮至幹。製得882mg(81% )標題化合物，為無色固體。ESI_MS(m/Z) :541[Μ_ΗΓ，[a]20D =-2· 2 (c = 1· 0，CH3OH)，Μ. ρ. :78· 3-79. 5°C。實施例42Glu-Asp-Gly-NHCH2 (CH2) 16CH3 (7f)的製備將1. 17g(l. 48mmol)HCl · Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 16CH3 用乙醇溶 解、加入適量Pd/C(約5% )、通H2(0. 02Mba)，室溫攪拌至原料點消失。濾除Pd/C、濾液減壓 濃縮至幹。製得828mg(79% )標題化合物，為無色固體。ESI_MS(m/Z) :569[Μ_ΗΓ，[a]20D =-2· 9 (c = 1· 0，CH3OH)，Μ. ρ. :79· 4-80. 8°C。試驗例1飽和脂肪鏈胺Glu-Asp-Gly三肽醯胺對小鼠脾淋巴細胞絲裂原增殖的抑 製作用脫頸處死小鼠，無菌取脾，用200目鋼網和注射器芯研磨，用HANK』 S液洗兩次， 1500轉/分條件下離心10分鐘，計數後用完全RPMI-1640培養液配成5X106/ml個脾淋 巴細胞，加100 μ 1細胞懸液於96孔培養板中(每孔含5Χ106個細胞)。每孔加20 μ 1 ConA (ConA終濃度為5 μ g/ml)，該96孔培養板置於體積分數為0. 05的CO2飽和溼度的培養 箱內37°C培養4h。4h後分別加入不同濃度飽和脂肪鏈胺Glu-Asp-Gly三肽醯胺(1X10_4M、 8X 1(Γ5Μ、5Χ 1(Γ5Μ、3Χ 1(Γ5Μ、1Χ 1(Γ5Μ、8Χ 1(Γ6Μ、5Χ ICT6M 和 IX I(T6M)，每個濃度 3 個復孔。 同時設不含化合物對照孔和只含同量培養液無ConA的細胞空白孔。各個孔均重複3次(η =3)。培養48h後用MTT法檢測化合物對脾淋巴細胞的抑制作用。按照公式「抑制率=(D對照-D含藥)/D對照X 100%」計算不同濃度飽和脂肪鏈 胺Glu-Asp-Gly三肽醯胺對脾淋巴細胞增殖的抑制作用，根據細胞相對生存率和化合物的 濃度繪製細胞生長曲線，利用該生長曲線求得半數抑制率(dxIC5ci)。結果列入表1。結果表明 本發明的飽和脂肪鏈胺Glu-Asp-Gly三肽醯胺對小鼠脾淋巴細胞增殖有明確的抑制作用。表1飽和脂肪鏈胺Glu-Asp-Gly三肽醯胺對小鼠脾淋巴細胞絲裂原增殖的抑制作 用 9 試驗例2飽和脂肪鏈胺Glu-Asp-Gly三肽醯胺對巨噬細胞吞噬的抑制作用將生長狀態良好、處於對數生長期的Ana-I小鼠巨噬細胞以1 X IO5個/mL的密度 接種於96孔板，每孔100 μ 1，37°C、5% CO2培養箱中培養4小時，按預設的濃度梯度加入經 滅菌處理的飽和脂肪鏈胺Glu-Asp-Gly三肽醯胺(1 X 10_4M、8X 10_5M、5X 10_5M、3X 10_5M、 1 X 10_5M、8X 10_6M、5X ΙΟ—Μ和1 X I(T6M)，每個濃度3個復孔，對照組加入等體積的溶解樣 品的溶媒。繼續培養24小時後，吸棄上清液，每孔加入100 μ 10. 的中性紅溶液，置於 37°C孵育30分鐘。吸棄中性紅溶液，並用PBS緩衝溶液洗滌2-3次(除去未被巨噬細胞吞 噬的中性紅)，加入細胞溶解液(乙醇乙酸=1 1)100 μ 1，4°C過夜，酶標儀檢測吸光度 值，波長540nm。各個孔均重複3次(η = 3)。按照公式「抑制率=(D對照-D含藥)/D對照Χ100%」計算不同濃度的化合物 對巨噬細胞的吞噬能力的抑制作用，根據細胞相對生存率和化合物的濃度繪製細胞生長曲 線，利用該生長曲線求得半數抑制率(dxIC5ci)。結果列入表2。結果表明本發明的飽和脂肪 鏈胺Glu-Asp-Gly三肽醯胺對Ana-I小鼠巨噬細胞吞噬有明確的抑制作用。表2飽和脂肪鏈胺Glu-Asp-Gly三肽醯胺對Ana-I小鼠巨噬細胞吞噬的抑制作用 試驗例3飽和脂肪鏈胺Glu-Asp-Gly三肽醯胺在納米水平的自組裝將飽和脂肪鏈胺Glu-Asp-Gly三肽醯胺配置成1 μ mol/ml的水溶液，在雷射納米 粒度儀上25°C測定粒徑。連續測定8天，記錄其粒徑。結果列入表3。數據表明，本發明的 飽和脂肪鏈胺Glu-Asp-Gly三肽醯胺水溶液中均能自組裝成粒經穩定在38. 9-1030nm的納 米球。表3飽和脂肪鏈胺Glu-Asp-Gly三肽醯胺在水中自組裝的納米球粒徑
權利要求
通式I的6種具有免疫抑制活性的飽和脂肪鏈胺Glu Asp Gly三肽醯胺Glu Asp Gly NH CH2 (CH2)nCH3 I通式I中的n＝6、8、10、12、14或16。
2.一種製備權利要求1的脂肪鏈胺Glu-Asp-Gly三肽醯胺的方法，包括(1)將N端保護基保護的甘氨酸與飽和脂肪胺縮合，所述飽和脂肪胺為CH3(CH2) nCH2NH2, η = 6、8、10、12、14 或 16 ；(2)脫去N端保護基得到飽和脂肪胺甘氨酸醯胺；(3)按照現有液相合成技術，將飽和脂肪胺甘氨酸醯胺與天冬氨酸的保護中間體、穀氨 酸的保護中間體逐步接肽合成保護基保護的飽和脂肪胺三肽綴合物；(4)依次脫去保護基保護的飽和脂肪胺三肽綴合物的N端保護基和C端保護基得到目 標化合物。
3.權利要求1的6種飽和脂肪鏈胺Glu-Asp-Gly三肽醯胺在製備免疫抑制劑類藥物中 的應用。
4.權利要求1的6種飽和脂肪鏈胺Glu-Asp-Gly三肽醯胺作為製備微乳或脂質體藥物 載體的製劑材料的用途。
5.權利要求1的6種飽和脂肪鏈胺Glu-Asp-Gly三肽醯胺作為製備微乳、脂質體藥物 載體的靶向製劑材料中的用途。全文摘要
本發明涉及通式I的6種具有免疫抑制活性的飽和脂肪鏈胺Glu-Asp-Gly三肽醯胺綴合物，在飽和脂肪鏈胺中n＝6、8、10、12、14或16，涉及它們的製備方法以及作為免疫抑制劑的應用。這些飽和脂肪鏈胺Glu-Asp-Gly三肽醯胺對脾淋巴細胞絲裂原增殖反應的抑制作用，以及對巨噬細胞吞噬活性的抑制作用的實驗結果表明，本發明的化合物具有優秀的免疫抑制作用，臨床上可作為免疫抑制劑應用。Glu-Asp-Gly-NH-CH2-(CH2)nCH3 I
文檔編號A61K47/42GK101899087SQ20091008532
公開日2010年12月1日 申請日期2009年5月26日 優先權日2009年5月26日
發明者彭師奇, 趙明, 趙淑銳 申請人:首都醫科大學