一種病圃中菸草黑脛病菌的生理小種鑑定方法
2024-03-01 16:36:15 1
專利名稱：：一種病圃中菸草黑脛病菌的生理小種鑑定方法
技術領域：
：本發明屬於植物病原鑑定
技術領域：
，具體涉及菸草黑脛病菌生理小種的鑑定與黑脛病抗性的鑑定，特別是涉及一種對菸草黑脛病菌生理小種鑑定的方法。
背景技術：
：菸草黑脛病是菸草(M'c^/""flto6a^m)生產上的毀滅性病害之一，是制約我國各煙區菸葉生產的最重要因素，可以危害烤菸、晾煙、曬煙、白肋煙、香料煙等所有的栽培菸草。美國北卡羅萊納州每年因菸草黑脛病損失的菸葉約佔總產量的1%2%，1995年和1996年兩年間因黑脛病造成的損失就達3610萬美元，佔病害總損失的35.13%，居各病害之首。該病在我國分布範圍很廣，除黑龍江省尚未發現之外，其餘各植煙省區(含臺灣省)均有發生。平均發病率為5%12%，嚴重田塊發病率高達75%，甚至造成絕收。據不完全統計，我國菸草黑脛病平均每年發病面積高達76373hm2，產量損失2869.26萬千克，產值損失超過l.23億元人民幣。生產實踐表明，防治黑脛病最經濟、有效、環保的措施就是選育抗病品種，抗性鑑定自然成為抗源挖掘利用、抗病育種、抗性監測等工作中重要的一環。菸草黑脛病菌的變異性是菸草黑脛病實施綜合防治計劃中應當注意的重要問題之一。在菸草的生產過程中，新的高毒力菌系或新的生理小種的出現，往往使一批抗病品種"喪失"抗病性而成為感病品種，造成病害大流行，於是人們又開始新的抗病育種工作。所以，明確菸草黑脛病菌的生理小種鑑定方法，研究菸草黑脛病菌生理小種的變化和組成，及其與寄主抗性間的關係，對菸草抗黑脛病育種工作是極端重要的。到目前為止，尚未見病圃中菸草黑脛病菌生理小種鑑定方法的報導，國內亦沒有針對某一明確的生理小種類型開展菸草黑脛病的抗病性鑑定。
發明內容本發明提出一種病圃中菸草黑脛病菌的生理小種鑑定方法，本發明採用鑑別寄主在田間的抗病反應與採集菌株在TTC固體培養基平板上的顏色變化相結合的方法，以儘快鑑定出對所測病圃中菸草黑脛病菌的生理小種，為菸草黑脛病的綜合防治和確立抗病育種的目標提供依據。本發明的目的通過以下技術方案實現一種病圃中菸草黑脛病菌的生理小種鑑定方法，包括以下順序步驟一、測定鑑別寄主在田間的抗病反應；在病圃中栽培鑑別寄主尺//"附^^剛》//(3、NC1071、L8、TV.m^/cm^;y、抗病對照K326、感病對照紅大和任意其他種質，如潘圓黃、BL-921、CV78-5。每品種設3個重複，按照病圃管理辦法進行管理，烤菸採收後挖根調査，按國家標準對鑑定品種進行分級和抗性評價。結合前人菸草黑脛病菌O、1、2和3號小種的寄主反應判斷生理小種類型。二、測定菌株在TTC固體培養基中的顏色變化；從病圃中隨機採集不同品種的病株，分離純化病原並鑑定後，進行TTC法測定。根據顏色變化判斷菸草黑脛病菌生理小種類型。三、綜合上述兩步鑑定結果，判斷生理小種類型。本發明率先提出了一種具有實用價值的菸草黑脛病菌生理小種鑑定方法，實現了對現有病圃中菸草黑脛病菌的生理小種類型進行鑑定，然後有針對性地開展菸草抗病種質資源篩選和菸草新品種選育等研究，是一種較為經濟實用的方法，具有良好的市場應用前景。圖1為供試菌株在TTC固體培養基上產生明顯的顏色變化的示意圖。具體實施例方式實施例l:1、材料與方法l.l供試材料l丄l培養基燕麥液體培養基用於搖床加富培養，燕麥固體培養基用於菌株活化與培養，加0.05g/mL氯黴素用於病原的分離與純化。蔗糖-檸檬酸-維生素-無機鹽(SCBM)液體培養基蒸餾水1000mL、蔗糖30g、檸檬酸20g、氯化鈣1.0g、硝酸鉀2.0g、磷酸二氫鉀0.67g、磷酸氫二鉀0.33g、1%三氯化鐵10滴、VB1lmg。TTC液體培養基為上述培養基中加入0.05%TTC;TTC固體培養基為燕麥瓊脂培養基內加入0.05%TTC。表1所用試劑規格、純度、廠家tableseeoriginaldocumentpage5l丄2供試品種iV.p/i/mk^!>H/o//a、NC1071、L8、iV.m^//cawfc、紅大(CK)、K326(CK)、潘圓黃、BL-921、CV78-5。1.2方法1.2.1鑑別寄主在田間的抗病反應在雲南省菸草科學研究所研和試驗基地進行試驗測定。利用有病連作煙田作病圃，誘其自然發病。06-08年自然病圃中種植iV.p/ww&gz>n:/b//a、NC1071、L8、W."w&cm^y、紅大(CK)、K326(CK)、潘圓黃、BL-921、CV78-5等品種，小區隨機排列，三次重複，每品種每重複種植一行，每行35株。栽培管理常規漂浮育苗、適齡移栽，煙苗成活後田間多澆水，保證田間溼度，施肥按常規管理。植株生長期均不施用殺菌劑，蟲害管理與大田管理相同。病害嚴重度分級按中華人民共和國菸草行業標準YC/T39的規定。抗性評價標準按中華人民共和國菸草行業標準YC/T41-1996的方法進行。自然發病於病發初期、盛期和未期各調查一次，每次均應調查各品種全部植株，並計算各品種的病株率、病情指數，然後以病情指數為主要依據評定各品種的抗病能力。(1)病害分級標準(以整株為單位)0級全株無病；1級莖部病斑不超過莖圍1/2，或半數以下葉片輕度凋萎，或下部少數葉片出現病斑；2級莖部病斑超過莖圍的1/2，或半數以上葉片調萎；3級莖部病斑環繞莖圍，或2/3以上葉片凋萎；4級病株全部葉片凋萎或枯死。病情指數計算病指-2X各級病株數x該病級值y(調査總株數x最高級值)x100(2)抗性評價標準高抗病情指數05，用HR表示；抗病病情指數為5.0125，用R表示；中抗病情指數25.0150，用MR表示；中感50.0175，用MS表示；感病病情指數75以上，用S表示。試驗數據用浙江大學唐啟義、馮明光編的實用統計分析及其DPS數據處理系統進行分析，分析抗病性差異。結合前人菸草黑脛病菌O、1、2和3號小種的寄主反應(表l)判斷生理小種類型。表l菸草黑脛病菌O、1、2和3號小種的寄主反應寄主名稱病害反應特殊反應0號小種1號小種2號小種3號小種RSRMS葉對0號小種感病NC1071RS/RN.咖cZ/cawfcRs//N.//柳6餵>^//"Rs//注病害反應R為抗病，MS為中感，S為感病。1.2.2供試菌株在TTC固體培養基平板上的顏色變化08年從玉溪研和自然抗性鑑定病圃中隨機採集4個不同品種的病株，分離純化病原並鑑定後，進行TTC法測定。TTC法測定的病菌在SCBM固體(pH5.5)培養基28。C恆溫培養，培養基分別加TTC(0.05。/。,w/v)和不加兩種處理，定期觀察菌落生長和顏色反應。每處理設3個重複，以不加TTC的燕麥瓊脂培養基為對照，觀察顏色反應。2結果與分析2.1供試菌株在TTC固體培養基平板上的顏色變化表2各分離物在TTC固體培養基內的變色反應培養基菡株編號採集品種時間2h12h24h48h72h96h120hBpl潘圓黃-+++++++++++++TTC固體培養基BP2BP3BL-921CV78-5-+++++++++++++++++++++BP4K326-++++++++++++Bpl潘圓黃CKBP2BP3BP4BL-921CV78-5K326注-無色(nocolour)+微紅(lightred)++淺紅色(red)+++深紅色(crimson)各分離物在培養基中生長時菌落呈放射狀，在顯微鏡下觀察，菌絲無隔膜，分枝多呈銳角，孢子囊形狀呈橢圓形，初生孢子囊無明顯乳突，成熟孢子囊頂端有一明顯乳突，接種紅大煙苗發病症狀同菸草黑脛病，確定為菸草黑脛病菌株。分離純化的4個菌株，在TTC固體培養基上產生明顯的顏色變化如表2和圖1所示，故該4個菌株應為0號或1號小種。2.2鑑別寄主在田間的抗病反應表3大田菸草種質資源的抗性評價品種名稱平均病指標準差抗性評價5%顯著水平1%顯著水平4.177.22RcBNC]0717.874.01RbcB24.070.80RbBTV.22.220.00RbcB紅大(CK)76.8518,85SAK326(CK)7.876.85RbcB結合田間抗性鑑定結果表3，鑑別寄主TV.m^/cm/to、L8、NC1071、W/^mkjg!'m:/b/&對菸草黑脛病菌表現為R，抗病對照K326表現抗病，感病對照紅大表現感病，病情指數高達76.85%，與其它抗病品種病指差異極顯著。結合已報導的四個小種的寄主反應(表1)，判斷該田塊黑脛病菌應為0號生理小種，從該大田中隨機採集的四個菸草品種潘圓黃、BL-921、CV78-5、K326上的菸草黑脛病菌，通過生理分化方法鑑定結果為0或1號生理小種，故確定所測病圃病原為0號生理小種。實施例2:該病圃中菸草黑脛病抗病種質資源的篩選菸草黒脛病是由菸草疫黴[屍/^鄉滅ora7ams7力'cavar."z'c加.a""g(BredadeHean)Tucker]引起的一種世界性菸草毀滅性真菌病害。病原菌屬鞭毛菌亞門疫黴屬，是喜高溫高溼的兼性寄生菌，可以危害所有的菸草類型，在菸草生長的任何階段都能侵染根、莖、葉，引起萎蔫、莖損傷和植株死亡。近年來，由於連作煙田面積擴大以及連作年限的增長，菸草黑脛病有加重流行的趨勢。為減輕該病造成的損失，人們曾用農業防治、化學防治、抗病育種等多種不同方法控制菸草黑脛病，但由於該病菌的遊動孢子形成速度快且數量大，侵染煙株後潛育期短、發病快，在一個生長季節可以發生多次再侵染，同時該病有時還與其它病害混合發生，一旦病害流行則難以控制。如果防治措施不到位黑脛病引起的損失可達100%。針對目前菸草黑脛病的嚴重危害，研究抗病新品種已成為當今防治菸草黒脛病的重點。本申請針對某一生理小種，開展菸草抗病種質資源的篩選，旨在為有效控制菸草黒脛病的發生、減小經濟損失提供理論依據。1材料與方法1.1試驗條件本研究田間試驗於2006~2008年在雲南省菸草科學研究所研和試驗基地進行，屬亞熱帶內陸高原型氣候，年平均氣溫15.523/TC，年平均降雨量700卯0mm。栽培土壤為紅壤土，根作層3545cm。1.2材料供試品種包括CV16-2、Iskngold、CV78-5、晉太7615、烏江1號、筑波1號、CV78-4、DarisSpecial、落地黃、NC2514、小黃金1025、MD609、革新三號、N.plumbaginifolia、G28、NC95、NC1071、L8、N.nudicaulis、CokerTobacco、H80A432、安選79-l、潘圓黃、NC86、、M二》卜、NC-22-NF、BL-921、曰本烤菸l、龍巖C2、津引1號、COM煙、OX414、RG12、K358、RG17、D101、80X2028。以G28、K326、革新三號為抗病對照品種，紅花大金元、小黃金1025為感病對照品種。1.3試驗設計06-08年採用單因素完全隨機區組設計，每一品種(系)為一處理，三次重複，每品種種植3墒，每墒18株，行株距為120cmX50cm，試驗田面積為2.3畝。移栽後團棵期進行高培土，整個大田期共噴施防蟲農藥4次，並未噴施抗菌類農藥。其他栽培管理措施均按照雲南省菸草科學研究所的生產技術方案要求進行。l丄4抗病性測定最後菸葉釆收完畢，挖根調査，計算各品種發病率和病情指數，以病情指數作為抗性指標，根據抗性劃分標準，評價各測定品種的抗病能力。病害調查分級標準與抗性劃分標準同前面1.2.1。2結果與分析2.1菸草種質資源抗性鑑定結果表4各鑑定材料病指間的差異顯著性處理08年病指抗性處理08年病指抗性BL-92199.07土L61aASNC-22-NF8.33土4.81ijklfJR紅大(CK)76,85土l&.85bABSDarisSpecial7.87士5.26ijkl1JR潘圓黃76.85士U.97bABSNC10717.87土德ijkLTR晉太761573.15士l3.49bBCMSK326(CK)7.87士6.85ijklIJRCV78匿554.63士25.20cBCDMSCokerTobacco7.87士7.13ijklIJRIskngold51.39i33.36cdBCDEMSD1017.41±6.99jklIJRM訓942.59i3.20cdeDEFMR落地黃6.02士7.13jklIJRa:。m42士l'.65cdefDEFGMRRG126.02土0.80jklJR筑波l號36.58土7.90cdefgDEFGHMR津引1號6.02±2.89jkllJR小黃金102532.87士4.88defghDEFGHIMRs、Y二卜5.09士2.12jk11JR革新三號29.17土17.07efghiDEFGHUMRN.plumbaginifolia4.17士7.22jklJHRCV16-225息12.50efghijEFGHIJRNC863.70士5.26jklJHR24.07士0.80efghijkFGHIJRK3583.70士2.89jklJHRN,nudicaulis22.22土0.00efghijklFGHLfROX4143.24士4.46jklJHR安選79-119.91士11.14fghijklFGHURCOM煙2.31士4.01kiJHR,M3216.67土11.87ghijklFGH[JRG28i.85士3.2UJHRNC251415.28士13.25hijklFGHURNC951.39士1.391JHR龍巖C214.35士17.69hijklG1IUR口本烤菸l139上1.391JHRtableseeoriginaldocumentpage10菸葉採收完畢後，挖根調査，計算病情指數，根據抗性評價標準評價種質資源的抗病性。通過對39份菸草種質資源抗黑脛病鑑定(表4)，抗病對照K326的平均病指7.87，抗性評價在抗病範圍內，感病對照紅大的平均病指為76.85，抗性評價在感病範圍內。菸草品種BL-921發病最重，病情指數最高，達99.07，高於紅大病指，與感病對照紅大間差異顯著，其餘品種發病輕於紅大，其中潘圓黃、晉太7615與紅大間差異不顯著，其餘品種與紅大差異顯著。RG17的病情指數最低，為0.93。高抗品種N./7/ww6塔/w/oto、G28、NC95、NC86、日本烤菸l、COM煙、0X414、K358、RG17與抗病對照品種K326差異不顯著，所有抗病品種CV16-2、CV78-4、DarisSpecial、落地黃、NC2514、NC1071、L8、N.m^caw/^、CokerTobacco、H80A432、安選79-l、二>卜、NC-22-NF、龍巖C2、津引l號、RG12、D101、OX2028與K326差異亦不顯著。感病品種有BL-921、紅大、潘圓黃、晉太7615、CV78-5、Islangold、MD609、烏江1號、筑波1號、小黃金1025與K326差異極顯著。權利要求1、一種病圃中菸草黑脛病菌的生理小種鑑定方法，其特徵在於步驟如下一、測定鑑別寄主在田間的抗病反應在病圃中栽培鑑別寄主，烤菸菸葉採收後挖根調查，按國家標準對鑑定品種進行分級和抗性評價，結合菸草黑脛病菌0、1、2和3號小種的寄主反應判斷生理小種類型；二、測定菌株在TTC固體培養基中的顏色變化；從病圃中隨機採集不同品種的病株，分離純化病原並鑑定後，進行TTC法測定。根據顏色變化判斷菸草黑脛病菌生理小種類型；三、綜合上述兩步鑑定結果，鑑別寄主在田間的抗病反應和TTC測定結果判斷生理小種類型。2、根據權利要求l所述的病圃中菸草黑脛病菌的生理小種鑑定方法，其特徵在於所述鑑別寄主為^/^附&*"//0/&、NC1071、L8和JV.m^/cawfc。3、根據權利要求l所述的病圃中菸草黑脛病菌的生理小種鑑定方法，其特徵在於所述抗病對照為K326。4、根據權利要求l所述的病圃中菸草黑脛病菌的生理小種鑑定方法，其特徵在於所述感病對照為紅大和任意其他種質，如潘圓黃、BL-921、CV78-5。全文摘要一種病圃中菸草黑脛病菌的生理小種鑑定方法，採用鑑別寄主在田間的抗病反應與採集菌株在TTC固體培養基平板上的顏色變化相結合的方法，可以儘快鑑定出對所測病圃中菸草黑脛病菌的生理小種，實現了對現有病圃中菸草黑脛病菌的生理小種類型進行鑑定，然後有針對性地開展菸草抗病種質資源篩選和菸草新品種選育等研究，為菸草黑脛病的綜合防治和確立抗病育種的目標提供依據；是一種較為經濟實用的方法，具有良好的市場應用前景。文檔編號C12Q1/18GK101671720SQ20091009499公開日2010年3月17日申請日期2009年9月22日優先權日2009年9月22日發明者勇劉,盧秀萍,李梅雲,李永平,高家合申請人:雲南省菸草農業科學研究院