海洋細菌交替假單胞菌lp621產右旋糖苷酶的方法及產品的製作方法

2024-03-26 04:41:05

專利名稱：：海洋細菌交替假單胞菌lp621產右旋糖苷酶的方法及產品的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種利用從中國黃海連雲港海域的海水中分離得到的交替假單胞菌LP621(屍化^o"/teramo"ossp.LP621)產右旋糖苷酶的方法與產品。
背景技術：
：右旋糖苷(Dextean)(ahomoglycanofD-glucopyranose)是95%為01-1,6糖苷鍵的多糖。右旋糖苷酶(Dextranase,a-D-1,6-Glucan-6-D-Glucanohydrolase，EC3.2丄11)，又叫a-葡聚糖酶，是專-'切割右旋糖苷(Dextean)中a-l，6糖苷鍵的水解酶(Khalikovaeta1.,2003)。右旋糖苷酶有很重要的應用價值，在齲齒防治、製糖工業和藥用右旋糖苷的生產等方面發揮著越來越重要的作用(Khalikovaeta1.,2005)。右旋糖苷酶在齲齒防治中的應用。口腔中的細菌發酵食物中的蔗糖，生成水溶性右旋糖苷。這些水溶性右旋糖苷在牙齒面形成牙菌斑，一些乳酸菌在此大量繁殖並分泌出--'些酸性物質，破壞牙釉質，從而導致齲齒。牙菌斑是齲齒和牙周病重要的致病因素之一。因此為了預防和控制齲齒和牙周病，抑制牙菌斑的發生和發展至關重要。利用右旋糖苷酶能有效抑制牙菌斑形成(Marottaetal.，2002;Mehvaretal.，2000;Banaseta1，.2003)。右旋糖苷酶是一種生物製劑，使用和保存簡便易行。無毒性，無耐藥性，不影響口腔內的菌群的生態平衡，對不會刷牙的嬰幼兒和不具備洗漱條件的情況下，是一種良好的預防牙齲齒斑的製劑。而每個人飯後，尤其是食用糖後應用添加有此酶的漱口劑，是一項很好的抑制菌斑形成，預防齲齒和牙周病的有效措施。近幾年各國在這一領域已作了深入研究，將具有降解菌齒斑能力的右旋糖苷酶添加到牙膏、漱口水和口香糖中，取得了良好的防治齲齒的效果。右旋糖苷酶在製糖工業中的應用。由於微生物的汙染，甘蔗在收割、運輸、儲藏、壓搾過程中，蔗糖會轉化成右旋糖苷，呈粘性。粘性的右旋糖苷對製糖工業的影響是不利的。它不僅消耗了蔗糖分子降低了收率，而且右旋糖苷的存在，造成甘蔗汁黏度增加，對沉澱過濾甚至傳熱帶來不良影響，使煮糖時間增加，廢蜜的提淨率降低，助晶分離困難，增加了能耗。嚴重時，會導致管道不暢，迫使停機清掃。在甘蔗壓榨過程中加入適量的右旋糖苷酶使右旋糖苷降解，可以解決上述問題(Egglestonaetal.,2005;Jime'nez2005)。右旋糖苷酶在藥用右旋糖苷生產中的應用。醫藥工業上，右旋糖苷主要用作血漿增量劑，即代血漿。目前醫藥上用的右旋糖苷有中分子量和低分子量兩種，中分子量限於70000左右，低分子量的為40000。目前，藥用右旋糖苷的生產主要是採用酸水解法，條件激烈，得率低，要求生產設備條件苛刻，如能採用酶法生產，可提高產率，降低成本(程秀蘭等，1992)。目前國內外報導的產生右旋糖苷酶微生物主要為青黴(Pem'"7/Zw附)、斯達油月旨酵母(Z^ow_yc&sstorfey/)、麴黴(爿s/erg/〃ws)、,連球菌(5Vreptococcws)、環狀芽孢桿菌(Sa"'〃w"Vrw/ara)(Khalikovaetal.,2005)。Korpela等從土壤中篩選到一株能產生熱穩定胞外右旋糖苷酶的芽孢桿菌，並對該酶進行了純化(Khalikovaetal.,2003)。Lgarashi等將大鼠鏈球菌(5V^p/ococa^右旋糖苷酶在大腸桿菌中表達，重組酶與那些來自的變形鏈球菌deptococcwsm幽wto)禾口遠緣鏈球菌deptococcusso6n'm/s)的右方定糖苷酶具有相似的性質如最適pH和最適溫度(Lgarashietal.，2004)。DomanKim等報導斯達油脂酵母(丄.W^fej;/)的右旋糖苷酶在S.cwev/w'"e中表達(Kangetal.，2005)。Roca等將(屍em'cz7/^mw/m'o/wfetw)右旋糖苷酶在(畢赤酵母屍/c/n'"p^ton'^Mw")中表達(Rocaetal.，1996)。國內僅見對淡紫擬青黴和焦麴黴產右旋糖苷酶以及斯達油脂酵母的右旋糖苷酶的研究(程秀蘭等，1992;Chenetal.,2008)。國內外對海洋細菌交替假單胞菌屬(屍w^foa/terawowo)產右旋糖苷酶的研究尚未見報導。
發明內容本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足，提供一種新的利用交替假單胞菌LP621產右旋糖苷酶的方法。本發明所要解決的另一技術問題是提供前述方法所產的右旋糖苷酶產口叩o以下對本發明的技術方案進行詳細的描述。本發明所涉及的交替假單胞菌LP621(/^w必aterawo"wsp.LP621)菌株己於2008年10月14日在GenBank公開，登陸號為EU849123，網址為http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgidb=nuccore&id=209362346;該菌株為公知公用材料，在該專利申請日起二十年內，公眾如果需要，淮海工學院海洋學院實驗室可對外提供。一、交替假單胞菌LP621(屍wWofl/fera/wwassp.LP621)菌株(以下簡稱菌株LP621)的分離培養方法、形態特徵與生理生化特徵。1.1分離培養方法菌株LP621通過以下的分離培養方法得到用初篩培養基從連雲港海域的牡蠣、海泥、海水、海蟹和紫菜等樣品初步篩選到io多株透明圈大的菌株，再通過產酶培養基復篩獲得菌株LP621。1.2形態特徵對該菌進行革蘭氏染色後，顯微鏡觀察該菌為革蘭氏陰性桿菌，有莢膜，無芽孢，大小為2.2-2.7pmx0.7-1.3nm。在含有右旋糖苷固體培養基上的菌落特徵直徑4mm-7mm，白色、溼潤、邊緣光滑、中間突起、能產生明顯的透明圈，見圖1。1.3生理生化特徵菌株LP621的生理生化特徵以及與其它交替假單胞菌的比較見表1、2。該菌株氧化酶為陽性，能發酵葡萄糖、甲基紅，不能發酵VP，無氯化鈉可生長，能液化明膠，能產生吲哚；能利用乳糖、纖維二糖、半乳糖、甘油、丙氨酸、穀氨酸、丙酮酸，而不能利用果糖、麥芽糖。通過Bergey，sManualofSystematicBacteriology(第二版)分析比較菌株GS230與i^e^foa/tercww"as屬內其它種間理化特徵，結果顯示菌株LP621同屍化wcfoa/feraAmwm的其它菌均有一定相似性，但又不完全相同，結合進化樹的結果初步推測該菌為交替假單胞菌的一表1菌株LP621的生理生化特徵菌株LP621P.fl,c,/cGS230_/tov,》"/c/rraHH407氧化酶+++VP---口引哚++-甲基紅+--革蘭氏染色---苯丙氨酸脫氨酶+NDNDNaCl依賴性+-+明膠水解酶+硫化氫--葡萄糖發酵+-_"+"為陽性，"一"為陰性，"d"為11-89%的陽性，"nd"為不確定表2菌株LP621理化特徵與其它交替假單胞菌的比較菌姓LP621Pfl/^/cflRc"refl^R/ifl/o/;/朋P做raWaJ^Mig"yicflW511.4菌株LP621的分子生物學鑑定用Takara試劑盒提取DNA模板，並於-4(TC保存。正向引物Pl:5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，反向引物P2:5'-CGGCTACCTTGTTACGAC-3'。反應體系50pl，Taq酶2U，反應條件為94。C預變性5min，94。C變性30s，54。C退火40s，72。C延伸lmin，35個循環，72。C延伸7min。PCR產物的純化、克隆、測序由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。擴增菌株LP621的16SrDNA，其長度為1500bp。將菌株LP621的16SrRNA基因序列提交GenBank資料庫，通過16SrDNA序列同源性比較，生長因子酶9%NaCI利用乳糖D-果糖D-半乳糖D-纖維二糖麥牙糖甘油蔗糖乙酸鹽丙酮酸鹽DL-a-丙氨酸L-穀氨酸D+++++++nd+++dnd+++dd+dddd+d++d++++++d+DD+DD+D++要素粉長。c需色澱生"M可以初步確認該兩種菌為交替假單胞菌屬(/^e"^ateromo"w)。將親緣關係較近的菌株16SrDNA應用MEGA軟體進行多重比較，用中鄰接法(Neibor-joiningmethod)建系統進化樹，如圖2所示，從進化樹可以看出菌株LP621與屍化WGtoa/feramowasefraocfom'j親緣關係最近，且在一個分支中，根據菌株的形態特徵、生理生化特徵、16SrDNA序列以及系統進化樹的結果，可鑑定菌株LP621為交替假單胞菌LP621(Aewt/oa/teramo"wsp.LP621)，菌株LP621的16SrDNA序列己提交到GenBank，其登陸號為EU849123。二、交替假單胞菌LP621的生長特性2.1本發明中涉及的培養基2216E培養基蛋白腖0.5%，酵母粉0.1%，瓊脂2%，陳海水配製，pH8.5。初篩培養基蛋白腖1%，牛肉膏0.5%，右旋糖苷0.2%，瓊脂2%，陳海水配製，pH8.0;產酶培養基酵母膏0.1%，蛋白腖0.1%，右旋糖苷1%，陳海水配製，pH8.0。微量礦物鹽(每升)CuS04'5H20,O.Olg;ZnS04'7H20,O.lg;CoCl2'6H20,0.005g;MnCl2-4H20,0.2g;Na2Mo04.2H20,O.lg;KBr,0.05g;KI,0.05g;H3B03,O.lg;NaF，0.05g;LiCl，0.05g;Al2(SO4)3,0.05g;NiCl2-6H20，O.Olg;VoS04'2H20,0.005g;H2W04.2H20，0.002g;Na2Se04，0.005g;SrC1.6H20,0.005g;BaCl2,0.005g。2.2種子液的製備將保藏在2216E培養基的交替假單胞菌LP621接種到2216E培養基中，轉速180r/min，裝液量20%，培養16h。2.3不同溫度對交替假單胞菌LP621生長的影響將種子液以2y。接種量於2216E培養基，轉速180r/min，裝液量20%，分別在不同溫度下培養，每隔一段時間測定細胞濃度，選擇在600nm波長下測定OD值，結果發現該菌株能夠在4t:下生長，其生長溫度範圍為4-37"C，最適生長溫度為25。C。2.4pH對交替假單胞菌LP621生長的影響在2216E培養基中加入終濃度為10mmol/L的磷酸醋酸硼酸(1:1:1)作為緩衝液，使培養基的pH分別為4.0-11.0之間，在25"C培養24小時，測定細胞濃度，生長pH範圍為5-10，最適生長pH為7.0。2.5NaCl對交替假單胞菌LP621生長的影響按照2.2方法製備種子液，在2216E培養基(將用海水配製改用微量礦物鹽溶液代替，每升培養基加入10ml)中加入NaCl，使之為0%到12。/。的NaCl，在25'C培養24小時，測定細胞濃度，生長的NaCl濃度為0.5。/。-12Q/。，最適生長的NaCl濃度為7%。三、產酶條件對酶產生的影響發明人對交替假單胞菌LP621產海洋右旋糖苷酶的產酶條件進行了較深入的研究，研究了不同因素對產酶的影響，在各種單因素優化的基礎上，選取了多因素進行了正交試驗，最終的優化結果較大的提高了產酶。3.1發酵時間對產酶的影響將種子液接入到發酵培養基中，在25"C、180r/min下，振蕩培養48h，每4h取出測酶活力及OD,。右旋糖苷酶活在24h之前，產酶量上升速度較快，到發酵24h時(即菌體生長到穩定期)產酶量最高，隨時間增加，酶活力逐漸下降，見圖3。在發酵前期主要是生長菌體，而進入穩定期後，菌體增殖到最大密度，碳源即將耗盡時，酶開始大量形成和分泌，酶活力達到最高峰。繼續培養進入衰亡期，菌體大量裂解，大量的酶進入胞外液，胞內酶活降低。3.2發酵溫度對產酶影響在不同溫度下進行發酵培養，結果顯示20-25t:時右旋糖苷酶產量達到最高，低於20°C、高於25。C的情況下產酶均迅速下降。15'C和30。C時分別只有最高產酶量60%和73.1%的產酶量。低於2CTC時菌體生長緩慢，產酶量也相應降低；而溫度高於25"C後，菌體代謝太快，衰老快，不利於產酶，見圖4。3.3培養基pH對產酶的影響在不同pH條件下發酵培養24h後測定右旋糖苷酶活力。實驗結果證明隨著pH的升高，酶產量逐漸增加，當pH達到6.0時產酶量達到最大；pH繼續升高，在pH7.0-9.0之間酶產量下降較小，趨勢平穩，酶活相當穩定；自pH9後,酶產量迅速下降。在低於pH5.0或高於pH10.0時酶產量均很低，見圖5。3.4不同NaCl濃度對產酶的影響如圖6所示，產右旋糖苷酶的量隨NaCl濃度的增加而逐漸增加，當培養基NaCl濃度升至4。/。時，產右旋糖苷酶最高，進一步升高NaCl濃度則會對菌體生長和右旋糖苷酶酶活積累產生一定的抑制作用。3.5裝液量對產酶的影響搖瓶裝液量分別為10%、15%、20%、25%、30°/。和40%進行發酵試驗，結果表明，裝液量太少溶氧過大，對菌體造成傷害不利於產酶，裝液量太多溶氧太差，不利於菌體生長，同樣降低產酶，結果顯示裝液量在25%時產酶最高。3.6不同碳氮源對產酶的影響分別在培養基中添加不同的碳源和氮源進行發酵培養，發酵24h後測定發酵液酶活力，結果發現，在碳源的比較中，麥芽糖最能促進產酶，乳糖和可溶性澱粉次之，葡萄糖、纖維素不利於產酶，培養基中添加不同碳源對產酶的影響較大；不同氮源的發酵結果顯示，胰蛋白腖最有利於產酶，酵母膏和酪蛋白、蛋白腖、玉米粉次之，無機氮源不利於產酶，見表3。本實驗證明適當調整培養基中的碳氮源，可以較高地促進右旋糖苷酶的產出。_表3碳氮源對產酶的影響_相對酶活(％)相對酶活(％)3.7響應曲面法(RSM)優化發酵條件3.7.1響應面設計實驗結果由響應面軟體設計的實驗方案進行實驗後，得出的結果如表4。從表上可以看出在培養基pH為7.0，時間為24h，麥芽糖濃度為1%，裝液量為25%觀1」得的酶活最高。表4響應面實驗設計及其實驗結果tableseeoriginaldocumentpage1228200.252038.128.036280.252035.936.748280.25203939.756200.752055.659.668200.752062.868.876280.7520S4.354.288280.752076.576.096200.253044.747.5108200.253039.241.6116280.253043.740.1128280.253048.546.8136200.753078.980.5148200.753091.993.4156280.753056.168.6168280.7530卯.l940175240.52547.841.9189240.52556.457.7197160.52562.361.3207320.52564.761.02172402511.118.62272412510087.9237240.51547.450.1247240.53585.578.1257240.5258179.026了240.52576.979.03.7.2二次回歸擬合以及方差分析以相對酶活為響應值，經回歸擬合後各試驗因子對響應值的影響可以用以下函數表示Y二a0+a'A+a2B+a3c+a4D+a5A2+a6B2+a7c2+a8D2+a9AB+a^AC+a"AD+ai2BC+a13BD+a"CD應用響應面軟體對26個響應值進行分析所得到的擬合全變量二次回歸方程各變量的偏回歸係數估計值及方差分析表見表5，由表5可知，決定係數R2=0.9013，說明回歸方程的擬合程度較好，因此可以用該回歸方程代替試驗真實點對試驗結果進行分析。由響應面軟體可以得出全變量二次回歸方程為Y=79.30+3.95A-0.063B+17.32C+7.00D-7.38A2-4.53B2-6.52C2-3.79D2+3.16AB+4.69AC+0.93AD-1.13BC-1.64BD+2.74CD表5回歸分析結果tableseeoriginaldocumentpage143.7.3最佳發酵條件的確定根據響應面軟體繪出的等高線和響應面立體分析圖可以得出培養基pH、麥芽糖濃度和裝液量對產酶的影響較大，這與方差分析中顯著性的分析結果相符。為了進一步確定最佳點的值，通過回歸方程可以計算出四個因素的最佳值為pH7.07，發酵時間21.94h，麥芽糖濃度0.42%，裝液量為21.88%時所得的相對酶活最高。四、右旋糖苷酶的性質4.1粗酶液的製備將種子液以2%的接種量接種於發酵培養基，180r/min，25。C培養24h，10000r/min離心5min，沉澱即為菌體。用緩衝液懸浮菌體，冰水浴中經超聲波破碎5min，12000r/min離心10min，取上清液即為右旋糖苷酶粗酶液。4.2酶作用溫度對酶活性的影響將右旋糖苷酶置於不同溫度下與底物發生反應，測定酶活力，結果見圖7，酶的最適作用溫度為30°C，2(TC仍有70%的酶活力。4.3酶的熱穩定性取適量酶液分別在不同溫度(30°C、40°C、50。C和80°C)下保溫2.5h，每隔0.5到lh取出一組樣品，迅速置於4。C冰箱內，待保溫結束後統一在標準條件下測定殘餘酶活，以未處理酶液的酶活設為100%。結果見圖8，50°C保溫2.5h後該酶依然有65。/。的活性，8(TC保溫2h，殘餘酶活為50%以上。4.4酶的作用pH對酶活性的影響將酶液與在不同pH的1.07。的右旋糖苷溶液中在3(TC下進行酶活力測定，不同pH值的緩衝液為50mM檸檬酸鈉緩衝液(pH3.0至lj6.0);50mM磷酸鈉緩衝液(pH6.0到8.0);50mMTris-鹽酸緩衝液(pH8.0to9.0);50mM甘氨酸-氫氧化鈉緩衝液(pH9.0到10.0)。結果見圖9，pH8.0-8.5該酶的活性最高，在pH5.5時酶活性有另一個峰值，由此可推測粗酶液中有兩種甚至兩種以上的酶。4.5酶的pH穩定性將50ul酶液與150ul不同pH的緩衝液混合，緩衝液為伯瑞坦-羅賓森(Britton-Robi歸n)緩衝溶液，pH分別為3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7,0、7.5、8.0、9.0、10.0，在30。C水浴鍋中保溫lh取出測定殘餘酶活，將未處理酶液的酶活設為100%。結果見圖10，結果表明在30。C保溫下lh後，右旋糖苷酶在pH6.0-8.0範圍內穩定，殘餘酶活力保持在80%以上，在pH4.0和pH10.0分別有78%和72%的酶活力。4.6金屬離子、化學試劑對酶的作用將各種金屬離子與酶液混合，使其最終濃度達到1.0mM、5.0mM，然後在3(TC下測酶活，結果見表6。將各種化學試劑與酶液混合，使其達到預定濃度，測定酶活，結果見表7。結果發現Ag+、Na+、Ba2+、K+對右旋糖苷酶有激活作用。低濃度的(^2+對右旋糖苷酶有激活作用，高濃度的<^2+會抑制該酶活性。Hg2+、Pb2+、Mn2+、Mg2+、Li2+、Al3+、Cu2+、Zn2+對酶有不同程度的抑制作用。其它金屬離子如Co2+、C一和F^+對該酶的影響不大。表6金屬離子對酶活力的影響tableseeoriginaldocumentpage16表7化學試劑對酶活力的影響tableseeoriginaldocumentpage164.7右旋糖苷酶活測定。①右旋糖苷酶活測定方法取"/。右旋糖苷溶液100pL加入10(VL酶液，空白不加酶液，代之以100^iL的去離子水，3(TC反應15min，立即放入冰浴中終止反應，加入200iiLDNS10(TC煮沸5min，終止反應並顯色，加入3mL去離子水振蕩混勻，取300)tiL於96孔酶標板上於520nm下進行吸光值測定；將10ul酶液加入到190ul1。/o的口T溶性澱粉Tris-HCl緩衝液(50mM，pH8.0)中，在3(TC水浴中反應15min,用DNS測定還原糖量。②酶活力單位定義酶活力單位的定義上述反應條件下每分鐘水解右旋糖苷產生l嗎麥芽糖所需的酶量，定義為一個酶活力單位(U)。經試驗證明，本發明所述的方法所產右旋糖苷酶和其它右旋糖苷酶一樣，也可以用於防治齲齒；或者在甘蔗壓榨過程中用用降解右旋糖苷；或者用作血漿增量劑。圖1為菌株LP621在含右旋糖酐的平板上的透明圈。圖2菌株16SrRNA進化樹分析圖。圖3時間對產酶和菌株生長的影響圖。圖4為溫度對產酶的影響圖。圖5為pH對產酶的影響圖。圖6為NaCl濃度對產酶的影響圖。圖7為溫度對酶活性的影響圖。圖8為溫度對酶熱穩定性的影響圖。圖9為pH對酶活力的影響圖。圖10為pH對酶穩定性的影響圖。具體實施例方式以下參照附圖，進一步描述本發明的具體技術方案，以便於本領域的技術人員進一步地理解本發明，而不構成對其權利的限制。實施例1。參照圖1-2。一種利用交替假單胞菌LP621sp.LP621)產右旋糖苷酶的方法，其步驟如下，將交替假單胞菌LP621(屍^Mcfoa/terawowoysp響LP621)菌株接種到2216E培養基中，轉速180r/min，裝液量20%，培養16h，得種子液；將種子液以2%的接種量接種於發酵培養基，180r/min，25。C培養24h，10000r/min離心5min，沉澱即為菌體；用緩衝液懸浮菌體，冰水浴中經超聲波破碎5min，12000r/min離心10min，取上清液即為右旋糖苷酶粗酶液。實施例2。實施例1所述的方法中，所述的交替假單胞菌LP621(/^Mc/oa/feramo"^sp.LP621)菌株具有以下特徵革蘭氏陰性桿菌，有莢膜，無芽孢，大小為2.2—2.7^1111><0.7—1.3^1111;菌株生理生化特徵為，該菌氧化酶為陽性，能發酵葡萄糖、甲基紅，不能發酵VP，無氯化鈉可生長，能液化明膠，能產生吲哚；能利用乳糖、纖維二糖、半乳糖、甘油、丙氨酸、穀氨酸、丙酮酸，不能利用果糖、麥芽糖。實施例3。參照圖1。實施例1所述的方法中，所述的交替假單胞菌LP621(戶化z^oa/terawo"wsp.LP621)菌株在含有右旋糖苷固體培養基上的菌落特徵為直徑4mm-7mm，白色、溼潤、邊緣光滑、中間突起、能產生明顯的透明圈。實施例4。參照圖3-5。實施例1所述的方法中，所述的交替假單胞菌LP62118(戶化w^a/fera奶o"ossp.LP621)菌株的生長溫度範圍為4-37°C;生長pH範圍為6-ll;生長的NaCl濃度範圍為0.5。/。-12。/。。實施例5。參照圖3-5。實施例1所述的方法中，所述的交替假單胞菌LP621(P化wcfoa/teramo"oysp.LP621)菌株最適生長溫度為25°C，最適生長pH為10.0，最適生長的NaCl濃度為7%。實施例6。參照圖6-10。一種如實施例1—5中任何一項所述的利用交替假單胞菌LP621產右旋糖苷酶的方法所產右旋糖苷酶，所述的右旋糖苷酶的理化性質為右旋糖苷酶的適合作用溫度為30°C，5(TC以下酶具有熱穩定性，在80。C保溫2.5h後該酶仍具有40%以上的活性；在pH6.0-8.0該酶穩定；Hg2+、Pb2+、Mn2+、Mg2+、Li2+、Al3+、Cu，PZn2+則對酶有抑制作用；Ag+、Na+、Ba2+、K+對該酶有激活作用；EDTA、TCA和NBS對該酶有抑制作用。權利要求1、一種利用交替假單胞菌LP621(Pseudoalteromonassp.LP621)產右旋糖苷酶的方法，其特徵在於，其步驟如下，將交替假單胞菌LP621(Pseudoalteromonassp.LP621)菌株接種到2216E培養基中，轉速180r/min，裝液量20％，培養16h，得種子液；將種子液以2％的接種量接種於發酵培養基，180r/min，25℃培養24h，10000r/min離心5min，沉澱即為菌體；用緩衝液懸浮菌體，冰水浴中經超聲波破碎5min，12000r/min離心10min，取上清液即為右旋糖苷酶粗酶液。2、根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的交替假單胞菌LP621(屍化Woa/feramowwsp.LP621)菌株具有以下特徵革蘭氏陰性桿菌，有莢膜，無芽孢，大小為2.2—2.7)iimx0.7—1.3pim;菌株生理生化特徵為，該菌氧化酶為陽性，能發酵葡萄糖、甲基紅，不能發酵VP，無氯化鈉可生長，能液化明膠，能產生吲哚；能利用乳糖、纖維二糖、半乳糖、甘油、丙氨酸、穀氨酸、丙酮酸，不能利用果糖、麥芽糖。3、根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的交替假單胞菌LP621(屍化wcfoa/toww"msp.LP621)菌株在含有右旋糖苷固體培養基上的菌落特徵為直徑4mm-7mm，白色、溼潤、邊緣光滑、中間突起、能產生明顯的透明圈。4、根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的交替假單胞菌LP621(PseM^a/teramo"assp.LP621)菌株的生長溫度範圍為4-37。C;生長pH範圍為6-11;生長的NaCl濃度範圍為0.5%-12%。5、根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的交替假單胞菌LP621(屍wwtfoa/terawo"必sp.LP621)菌株適合生長溫度為25°C，適合生長pH為10.0，適合生長的NaCl濃度為7%。6、一種如權利要求l一5中任何一項所述的利用交替假單胞菌LP621產右旋糖苷酶的方法所產右旋糖苷酶，其特徵在於，所述的右旋糖苷酶的理化性質為右旋糖苷酶的最適作用溫度為3(TC，5(TC以下酶具有熱穩定性，在8(TC保溫2.5h後該酶仍具有40。/o以上的活性；在pH6.0-8.0該酶穩定；Hg2+、Pb2+、Mn2+、Mg2+、Li2+、Al3+、012+和Zn2+則對酶有抑制作用；Ag+、Na+、Ba2+、K+對該酶有激活作用；EDTA、TCA和NBS對該酶有抑制作用。全文摘要本發明是一種利用海洋細菌交替假單胞菌LP621(Pseudoalteromonassp.LP621)產右旋糖苷酶的方法，其特徵在於，其步驟如下，將交替假單胞菌LP621(Pseudoalteromonassp.LP621)菌株接種到2216E培養基中，轉速180r/min，裝液量20％，培養16h，得種子液；將種子液以2％的接種量接種於發酵培養基，180r/min，25℃培養24h，10000r/min離心5min，沉澱即為菌體；用緩衝液懸浮菌體，冰水浴中經超聲波破碎5min，12000r/min離心10min，取上清液即為右旋糖苷酶粗酶液。本發明還涉及按該方法得到的右旋糖苷酶產品，該右旋糖苷酶在齲齒防治、製糖工業和藥用右旋糖苷的生產等方面發揮著重要的作用。文檔編號C12R1/38GK101519656SQ20091002958公開日2009年9月2日申請日期2009年3月27日優先權日2009年3月27日發明者姝劉,呂明生,房耀維,朱廣超,王淑軍,麗陳申請人:淮海工學院