甜葉菊種苗的組培快繁技術的製作方法
2024-03-26 12:57:05 1
專利名稱：甜葉菊種苗的組培快繁技術的製作方法
技術領域：
本發明涉及甜葉菊種苗的組培快繁技術。
背景技術：
菊科甜菊屬甜葉菊種，學名Mevia rebaudianum Bertoni，多年生草本植物。原產南美洲巴拉圭和巴西交界的阿曼拜山脈，是一種很有價植的糖料作物。整株都含有糖分，以葉片的甜度最高。含糖苷14%，枝梗的糖苷相當於葉片的一半。葉片經曬乾粉碎後即可當糖料，或經熱酒精處理，乙醚沉析也可獲得20-26%蛋黃色粗提物，甜度為白砂糖的100-150 倍，精製品白色，甜度相當於白砂糖的250-300倍，而熱量僅為白砂糖的1/300。甜菊已替糖精，廣泛應用在食品工業上；作為淹漬劑加入醬油、醬瓜及其它醬品中，有防腐作用。作為強壯劑、醒酒劑、健胃劑，其功能具有提高血糖，促進人體代謝的作用。甜葉菊用途非常廣泛，甜葉菊中的糖分目前是世界上公認的第三代糖源，對人體有降血壓、強壯身體、治糠尿病作用；開發甜葉菊茶，能夠有效緩解精神疲勞，促進新陳代謝，有益於人體健康，是現代安全保健糖料。該項目以科技為第一生產力，努力做好甜葉菊的優質種苗繁育和推廣工作，為人類的健康、幸福助威。目前甜菊種植方式不科學，導致成本較高，產量較低，市場供應不足。
發明內容
本發明的目的在於克服現有技術中的不足，提供甜葉菊種苗的組培快繁技術。1、設施設備
擁有交通方便、環境清潔、空氣乾燥的實驗室化學實驗室、洗滌室、滅菌室、接種室、培養室；生產所需的生產設備高壓蒸汽滅菌器、超淨工作檯、電子天平、解剖鏡、空調、培養架、加溫器、培養瓶，以及各類化學試劑；有可供品種試驗的試驗地、種苗假植大棚及種源圃(母本園)；
2、母本園
由無病蟲危害、無病毒侵染的優良甜葉菊株組成，母本園附近500m範圍內不能有蚜蟲傳播病毒的作物，有5(Tl00m的隔離區，並有良好的排灌設施；
3、種源的選取
甜葉菊花期長達2個月，高溫季節結實率低。為培育甜葉菊良種種子，宜在3月份選擇親和力強、高產、高含量的父母本組合隔行種植；根據「節數平均M節，葉片大、莖杆粗壯、生長迅速、適應性強」的原則對單植株進行初步篩選，將初選植株的葉片使用直徑 0. 5-1. 5cm打孔器打孔，避開葉片的主脈打取1-10片，重量0. 5g ；將葉片破碎後，採用下列測定糖甙的試劑組成進行一般性測定。將200g酒石酸鈉，10-30g氫氧化鈉溶於0. 8L蒸餾水中；攪拌加熱下，將3，5- 二硝基水楊酸3-9g、結晶酚3-9g、亞硫酸鈉3-9g，先後於溶液中溶解；最後再加入鐵氰化鉀0. 1-0. 5g使其溶解，冷卻後加蒸餾水定容至IL所得到的溶液； 在上述的一般性測定數據結果中優選出優良單株，優良單株佔單株的0. 1%-10%，利用HPLC對優良單株葉片中的甜葉菊糖甙做進一步分析，初步獲得的甜葉菊糖甙含量較高的優良植株，以這些植株為材料進行組織培養擴繁，甜葉菊再生體系的外植體為無菌苗的莖尖；
4、培養基的配製 4. 1母液的配製
4. 1. 1基本培養基MS的母液配製
將MS中所含的化學成份按大量元素(NH4N03、KN03、CaCl2 · 2H20、MgS04 · 7H20、 KH2P04), WmTtM (KI > H3B03, MnS04 · 4H20, ZnS04 · 7H20、Na2Mo04 · 2H20、CuS04 · 5H20、 CoC12 ·6Η20)、鐵鹽(FeS04 ·7Η20、Ν&2Ε ΤΑ ·2Η20)、有機物(維生素類、肌醇、甘氨酸)、蒸溜水，按照10 1:100:100:1000溶解後配製成的母液，裝入容量瓶後置於冰箱中保存；
4.1. 2生長激素的配製
將生產所需的細胞分裂素6-BA (6-苄基腺嘌呤)、Ad (腺嘌呤)及生長素NAA (萘乙酸)、 IBA(吲哚丁酸)用lmol/1 HCl或酒精溶解，再用蒸溜水稀釋後分別配製成200mg/l的母液， 裝入容量瓶中，置於冰箱保存；
5、外植體的獲得 5. 1材料的處理 5. 1. 1初處理
將吸芽外層苞片仔細剝去，經自來水衝洗乾淨後，保留頂芽和側芽原基，切割成約2cm 假莖、2cm直徑的圓柱； 5. 1. 2滅菌
在超淨工作檯上將切好的吸芽先放入75%的乙醇溶液中浸泡30s後，用無菌水洗淨，再放入0. l%HgC12或5%次氯酸鈉溶液中l(T20min後，用無菌水衝洗5 8次； 5. 1. 3切割及接種
在超淨工作檯上將已滅菌的吸芽置於無菌墊紙上，用事先已滅菌的手術刀、鑷子取吸芽中心大小約0. 5^0. 8cm3的材料，並將其均勻切成四小塊，接種於事先準備好的誘導培養基中，每瓶一塊。基部切口應插入培養基內，在整個材料處理過程中要動作迅速，減少暴露在空氣中的時間，減少因褐變而導致誘導的失敗； 5. 2誘導培養基
MS+6-BA0. 6mg/L) +NAAO. 25mg/L+3% 蔗糖 +0. 7% 瓊脂，
5.3培養條件
培養室溫度(25士 1) °C，相對溼度60%-70%，光照強度2000-30001XmOl / (m2/s), 先暗培養2d再進行Mh / d的光培養，各種培養基在高壓滅菌前pH均調至5. 8 ；
6、繼代培養
6. 1繼代培養基
MS+6-BA0. 5mg/L+NAA0. 05mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 6g/L，pH 值為 5. 8 左右； 6. 2培養條件
培養室溫度(25 士 1) °C，相對溼度60%-70%，光照強度2000-30001XmOl / (m2/s), 先暗培養2d再進行Mh / d的光培養，各種培養基在高壓滅菌前pH均調至5. 8 ； 6. 3方法只有經檢驗合格的材料才可以進行繼代培養，每2(T30d繼代增殖一次。為保證種性不受影響，減少變異率，繼代次數宜控制在10代以內，最多不得超過15代，接種時，用手術刀將叢生芽以2 3個芽為一個單位分開，同時為減弱頂端優勢，促進基盤腋芽生長，切割時將主莖上部的大部分假莖葉切去，每瓶放入3、塊，合計10個芽左右； 7、生根培養 7. 1生根培養基
1/4MS+ IBAO. lmg/L+NAAO. lmg/L ； 7. 2培養條件
培養室溫度(25 士 1) V，相對溼度60%-70%，光照強度2000-30001xmOl/ (m2/s)，先暗培養2d再進行Mh/d的光培養，各種培養基在高壓滅菌前pH均調至5. 8 ； 7. 3方法
甜葉菊試管苗在培養瓶中培養至長有6片以上葉子和發達的根系後。先敞口煉苗2d， 用上述培養液浸根2d(促使根系進一步生長及在根的表面形成一層根絨毛)後洗淨根部， 將苗轉入裝有土沙並澆少量培養液(1/20MQ的小花盆中，為了提高莖稈強度，增強抗倒伏能力，可在沙土中添加少量草木灰，澆足水，如果室外溫度達不到25°C左右，可暫時將小花盆放入溫度適宜的溫室中，每隔2d澆1次水，如室溫適宜.可先放在室內陰涼處，每l-2d 澆1次水，4-5d後，如果苗長勢良好，則可移入陽光下培養，定期澆水，待小苗成活後，溫度適宜時再移於大地栽培。有益效果
本發明可以培養出大量的優質甜菊苗，解決市場上甜菊供不應求的局面，有利於大面積推廣甜菊種植，增加國民收入。
具體實施例方式為了使本發明的技術手段、創作特徵、工作流程、使用方法達成目的與功效易於明白了解，下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。1、設施設備
擁有交通方便、環境清潔、空氣乾燥的實驗室化學實驗室、洗滌室、滅菌室、接種室、培養室；生產所需的生產設備高壓蒸汽滅菌器、超淨工作檯、電子天平、解剖鏡、空調、培養架、加溫器、培養瓶，以及各類化學試劑；有可供品種試驗的試驗地；
2、選母本園
由無病蟲危害、無病毒侵染的優良甜葉菊株組成，母本園附近500m範圍內不能有蚜蟲傳播病毒的作物，有IOOm的隔離區，並有良好的排灌設施；
3、種源的選取
甜葉菊花期長達2個月，高溫季節結實率低，為培育甜葉菊良種種子，宜在3月份選擇親和力強、高產、高含量的父母本組合隔行種植；根據「節數平均M節，葉片大、莖杆粗壯、 生長迅速、適應性強」的原則對單植株進行初步篩選，將初選植株的葉片使用直徑Icm打孔器打孔，避開葉片的主脈打取6片，重量0. 5g ；將葉片破碎後，採用下列測定糖甙的試劑組成進行一般性測定。將200g酒石酸鈉，20g氫氧化鈉溶於0.8L蒸餾水中；攪拌加熱下，將 3，5- 二硝基水楊酸5g、結晶酚6g、亞硫酸鈉6g，先後於溶液中溶解；最後再加入鐵氰化鉀0. 3g使其溶解，冷卻後加蒸餾水定容至IL所得到的溶液；在上述的一般性測定數據結果中優選出優良單株，優良單株佔單株的7%，利用HPLC對優良單株葉片中的甜葉菊糖甙做進一步分析，初步獲得的甜葉菊糖甙含量較高的優良植株，以這些植株為材料進行組織培養擴繁，甜葉菊再生體系的外植體為無菌苗的莖尖； 4、培養基的配製 4. 1母液的配製
4. 1. 1基本培養基MS的母液配製
將MS中所含的化學成份按大量元素(NH4N03、KN03、CaCl2 · 2H20、MgS04 · 7H20、 KH2P04), WmTtM (KI > H3B03, MnS04 · 4H20, ZnS04 · 7H20、Na2Mo04 · 2H20、CuS04 · 5H20、 CoC12 ·6Η20)、鐵鹽(FeS04 ·7Η20、Ν&2Ε ΤΑ ·2Η20)、有機物(維生素類、肌醇、甘氨酸)、蒸溜水，按照10 1:100:100:1000溶解後配製成的母液，裝入容量瓶後置於冰箱中保存；
4.1. 2生長激素的配製
將生產所需的細胞分裂素6-BA (6-苄基腺嘌呤)、Ad (腺嘌呤)及生長素NAA (萘乙酸)、 IBA(吲哚丁酸)用lmol/1 HCl或酒精溶解，再用蒸溜水稀釋後分別配製成200mg/l的母液， 裝入容量瓶中，置於冰箱保存；
5、外植體的獲得 5. 1材料的處理 5. 1. 1初處理
將吸芽外層苞片仔細剝去，經自來水衝洗乾淨後，保留頂芽和側芽原基，切割成約2cm 假莖、2cm直徑的圓柱； 5. 1. 2滅菌
在超淨工作檯上將切好的吸芽先放入75%的乙醇溶液中浸泡30s後，用無菌水洗淨，再放入0. l%HgC12或5%次氯酸鈉溶液中15min後，用無菌水衝洗7次； 5. 1. 3切割及接種
在超淨工作檯上將已滅菌的吸芽置於無菌墊紙上，用事先已滅菌的手術刀、鑷子取吸芽中心大小約0. 7cm的材料，並將其均勻切成四小塊，接種於事先準備好的誘導培養基中， 每瓶一塊，基部切口應插入培養基內，在整個材料處理過程中要動作迅速，減少暴露在空氣中的時間，減少因褐變而導致誘導的失敗； 5. 2誘導培養基
MS+6-BA0. 6mg/L) +NAAO. 25mg/L+3% 蔗糖 +0. 7% 瓊脂，
5.3培養條件
培養室溫度(25士 1) 0C，相對溼度70%，光照強度21001Xmol / (m2/s)，先暗培養2d 再進行Mh / d的光培養，各種培養基在高壓滅菌前pH均調至5. 8;
6、繼代培養
6. 1繼代培養基
MS+6-BA0. 5mg/L+NAA0. 05mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 6g/L，pH 值為 5. 8 左右； 6. 2培養條件
培養室溫度(25 士 1) °C，相對溼度70%，光照強度21001Xmol / (m2/s)，先暗培養2d 再進行Mh / d的光培養，各種培養基在高壓滅菌前pH均調至5. 8 ；6.3培養方法
只有經檢驗合格的材料才可以進行繼代培養，每21d繼代增殖一次。為保證種性不受影響，減少變異率，繼代次數宜控制在10代以內，最多不得超過15代，接種時，用手術刀將叢生芽以2個芽為一個單位分開，同時為減弱頂端優勢，促進基盤腋芽生長，切割時將主莖上部的大部分假莖葉切去，每瓶放入3塊，合計10個芽左右；
7、生根培養
7. 1生根培養基
1/4MS+ IBAO. lmg/L+NAAO. lmg/L;
7. 2培養條件
培養室溫度(25 士 1) V，相對溼度70%，光照強度2000-30001xmOl/ (m2/s)，先暗培養2d 再進行Mh/d的光培養，各種培養基在高壓滅菌前pH均調至5. 8 ；
7. 3培養方法
甜葉菊試管苗在培養瓶中培養至長有6片以上葉子和發達的根系後。先敞口煉苗2d， 用上述培養液浸根2d (促使根系進一步生長及在根的表面形成一層根絨毛)後洗淨根部， 將苗轉入裝有土沙並澆少量培養液(1/20MQ的小花盆中，為了提高莖稈強度，增強抗倒伏能力，可在沙土中添加少量草木灰，澆足水，如果室外溫度達不到25°C左右，可暫時將小花盆放入溫度適宜的溫室中，每隔2d澆1次水，如室溫適宜.可先放在室內陰涼處，每2d澆1 次水，4d後，如果苗長勢良好，則可移入陽光下培養，定期澆水，待小苗成活後，溫度適宜時再移於大地栽培。 以上顯示和描述了本發明的基本原理和主要特徵和本發明的優點。本行業的技術人員應該了解，本發明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發明的原理，在不脫離本發明精神和範圍的前提下，本發明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發明範圍內。本發明要求保護範圍由所附的權利要求書及其效物界定。
權利要求
1.甜葉菊種苗的組培快繁技術，其特徵在於，包括以下步驟(1)、設施選取擁有交通方便、環境清潔、空氣乾燥的實驗室化學實驗室、洗滌室、滅菌室、接種室、培養室；生產所需的生產設備高壓蒸汽滅菌器、超淨工作檯、電子天平、解剖鏡、空調、培養架、加溫器、培養瓶，(2)、選母本園由無病蟲危害、無病毒侵染的優良甜葉菊株組成，母本園附近500m範圍內不能有蚜蟲傳播病毒的作物，有5(Tl00m的隔離區，並有良好的排灌設施；(3)、種源的選取甜葉菊花期長達2個月，高溫季節結實率低，為培育甜葉菊良種種子，宜在3月份選擇親和力強、高產、高含量的父母本組合隔行種植；根據「節數平均M節，葉片大、莖杆粗壯、生長迅速、適應性強」的原則對單植株進行初步篩選，將初選植株的葉片使用直徑 0. 5-1. 5cm打孔器打孔，避開葉片的主脈打取1-10片，重量0. 5g ；將葉片破碎後，採用下列測定糖甙的試劑組成進行一般性測定，將200g酒石酸鈉，10-30g氫氧化鈉溶於0. 8L蒸餾水中；攪拌加熱下，將3，5- 二硝基水楊酸3-9g、結晶酚3-9g、亞硫酸鈉3-9g，先後於溶液中溶解；最後再加入鐵氰化鉀0. 1-0. 5g使其溶解，冷卻後加蒸餾水定容至IL所得到的溶液；(4)、培養基的配製(4. 1)基本培養基MS的母液配製將MS中所含的化學成份按大量元素(NH4N03、KN03、CaCl2 · 2H20、MgS04 · 7H20、 KH2P04), WmTtM (KI > H3B03, MnS04 · 4H20, ZnS04 · 7H20、Na2Mo04 · 2H20、CuS04 · 5H20、 CoC12 ·6Η20)、鐵鹽(FeS04 ·7Η20、Ν&2Ε ΤΑ ·2Η20)、有機物(維生素類、肌醇、甘氨酸)、蒸溜水，按照10 1:100:100:1000溶解後配製成的母液，裝入容量瓶後置於冰箱中保存；(4. 2)生長激素的配製將生產所需的細胞分裂素6-BA (6-苄基腺嘌呤)、Ad (腺嘌呤)及生長素NAA (萘乙酸)、 IBA(吲哚丁酸)用lmol/1 HCl或酒精溶解，再用蒸溜水稀釋後分別配製成200mg/l的母液， 裝入容量瓶中，置於冰箱保存；(5)、外植體的獲得(5. 1)初處理將吸芽外層苞片仔細剝去，經自來水衝洗乾淨後，保留頂芽和側芽原基，切割成1. 5-2. 5cm假莖、1. 5—2. 5cm直徑的圓柱；(5. 1. 2)滅菌在超淨工作檯上將切好的吸芽先放入75%的乙醇溶液中浸泡25-3 後，用無菌水洗淨，再放入0. l%HgC12或5%次氯酸鈉溶液中l(T20min後，用無菌水衝洗5、次；(5. 1.3)切割及接種在超淨工作檯上將已滅菌的吸芽置於無菌墊紙上，用事先已滅菌的手術刀、鑷子取吸芽中心大小約0. 5^0. 8cm3的材料，並將其均勻切成四小塊，接種於事先準備好的誘導培養基中，基部切口應插入培養基內，在整個材料處理過程中要動作迅速，減少暴露在空氣中的時間，減少因褐變而導致誘導的失敗；(5. 2)誘導培養基MS+6-BA0. 6mg/L) +NAAO. 25mg/L+3% 蔗糖 +0. 7% 瓊脂，(5. 3)培養條件培養室溫度(25士 1) °C，相對溼度60%-70%，光照強度2000-30001XmOl / (m2/s), 先暗培養2d再進行Mh / d的光培養，各種培養基在高壓滅菌前pH均調至5. 8 ；(6)、繼代培養，繼代培養基MS+6-BA0.5mg/L+NAA0. 05mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 6g/ L, pH值為5. 8左右，培養條件培養室溫度(25士 1) °C，相對溼度60 %-70%，光照強度 2000-30001xmol / (m2/s)，先暗培養2d再進行Mh / d的光培養，各種培養基在高壓滅菌前PH均調至5. 8 ；培養方法只有經檢驗合格的材料才可以進行繼代培養，每2(T30d繼代增殖一次，繼代次數宜控制在10代以內，最多不得超過15代，接種時，用手術刀將叢生芽以 2 3個芽為一個單位分開，同時為減弱頂端優勢，促進基盤腋芽生長，切割時將主莖上部的大部分假莖葉切去，每瓶放入3、塊，合計10個芽左右；(7)、生根培養，生根培養基1/4MS+IBAO. lmg/L+NAAO. lmg/L，培養條件培養室溫度 (25 士 1) °C，相對溼度60%-70%，光照強度2000-30001xmOl/ (m2/s)，先暗培養2d再進行Mh/ d的光培養，各種培養基在高壓滅菌前pH均調至5. 8 ；培養方法甜葉菊試管苗在培養瓶中培養至長有6片以上葉子和發達的根系後，先敞口煉苗2d，用上述培養液浸根2d後洗淨根部，將苗轉入裝有土沙並澆少量培養液(1/20MQ的小花盆中，可在沙土中添加少量草木灰，澆足水，如果室外溫度達不到25°C左右，可暫時將小花盆放入溫度適宜的溫室中，每隔 2d澆1次水，如室溫適宜.可先放在室內陰涼處，每l-2d澆1次水，4-5d後，如果苗長勢良好，則可移入陽光下培養，定期澆水，待小苗成活後，溫度適宜時再移於大地栽培。
全文摘要
甜葉菊種苗的組培快繁技術，包括以下步驟(1)設施選取；(2)選母本園；(3)種源的選取；(4)培養基的配製；(5)外植體的獲得；(6)繼代培養；(7)生根培養。本發明可以培養出大量的優質甜菊苗，解決市場上甜菊供不應求的局面，有利於大面積推廣甜菊種植，增加國民收入。
文檔編號A01H4/00GK102165919SQ20111002982
公開日2011年8月31日 申請日期2011年1月27日 優先權日2011年1月27日
發明者孫景文, 陽晃江, 馬光明 申請人:贛州菊隆高科技實業有限公司