光學超表面的類型及應用（3分鐘了解光學超分辨技術進展-STED）

2023-04-15 08:53:50

作者：席鵬、李美琪

北京大學工學院生物醫學工程系

早在2009年，Nature Publishing Group便空前的為超分辨顯微頻繁出新專輯，足以反映光學超分辨的熱度。

那麼，什麼是光學超分辨？如何實現光學超分辨？

山窮水盡疑無路

顯微的發展離不開光學，而光學的發展需要三大件：理論、材料、工程。這三大件，居然在20世紀初的德國小鎮耶拿相聚了。那裡有光學泰鬥阿貝Ernst Karl Abbe、光學玻璃大家Otto Schott和光學工程大師Carl Zeiss。後兩人都同時進入商界，並以他們的家族名稱作為公司的名稱，至今仍是世界上數一數二的巨頭。

阿貝則深入研究了在傳統光學中，如何能夠提高解析度，以及是否能夠無限提高解析度的問題。光學顯微由於光束直徑有限，透鏡大小有限，會產生衍射，從而具有—個所謂的衍射極限：

這個式子也是一個點擴展函數(PSF)的半高全寬的描述。它說明如果一次把處於這個半徑裡面的粒子亮起來，那用光學顯微是無法分辨它們的。所以，這個公式也就是光學顯微解析度的描述。

STED--You jump，I jump

Stefan Hell提出：是否可以通過兩步的方法來實現分辨？

這個問題如果用通俗的語言描述，就是，如果你有一根粗筆，如何用它畫細線？

你可能會想到，買塊橡皮。先畫個粗的，再擦去兩邊的多餘部分，自然就是細線了。沒錯，STED用的就是這個原理。

STED，全名是Stimulated Emission Depletion，受激輻射光淬滅。如下圖所示STED系統結構示意圖，在右上角，有—副能級圖。其中，你看到紅色的箭頭和黃色的箭頭了嗎？

圖 STED系統結構示意圖

綠箭頭代表粒子從低能級S0被激發到高能級S1，然後又弛豫到亞穩態-高能級的最低點。接下來粒子會在這休息一下，這個短到幾個納秒的快樂時光被叫做粒子的壽命(lifetime)。然後粒子選擇不在S1，回到S0，正所謂「吾欲乘風歸去，又恐瓊樓玉宇，高處不勝寒......」

這大概是絕大多數電子的選擇。跳下來的時候它們會降落在S0能級的不同高處，並形成—定的分布。這個分布我們可以用發射光譜來描述其統計特性，如下圖某染料ATTO 647N的激發光譜（藍色曲線）與發射光譜（紅色曲線）。可見，粒子輻射躍遷從620-850 nm均有可能，在670 nm處機率最大。

圖螢光吸收與發射光譜

「這樣不好」，有一個同學突然站起來說，「看著不整齊。」他就是愛因斯坦。相信大家都看過《鐵達尼號》，「如果Rose遇到了Jack，那麼他倆會一起跳，不分你我」。後來發明的雷射Laser，其中的SE就是受激輻射。正因為這整齊劃一的一躍，使得雷射成為功率最強的光。

Stefan Hell則靈光一閃，提出可以把受激輻射和自發輻射分開。

先返回到剛才那個黃箭頭和紅箭頭。如果綠色箭頭引發的螢光現象的最小PSF是綠色的圓圈半徑，這時候如果給它套上—個紅色橡皮擦（粒子做受激輻射波長相同），不就剩下為數不多、居於中間的螢光了嗎？縮小點擴展函數，這不就是超分辨嗎？

選—種合適的螢光物質，按順序先給激發脈衝(2 ps左右），等它躍遷上去了馬上給—個受激輻射波長的脈衝(250 ps左右），然後用二向色鏡區分受激輻射跟自發輻射，探測過來的自發輻射信號。受激輻射越大（橡皮搖得乾淨），剩下的PSF越小，也就是解析度越高。這個就是Pulsed STED。當然，如果覺得時間控制太麻煩，其實可以都給連續信號，因為反正二向色鏡能區分，只不過擦得沒那麼乾淨，這個就是cw STED。

圖共聚焦與STED的對比（圖像來源：Leica網站）

圖麻省理工大學製作的愛因斯坦－夢露圖

你看出愛因斯坦和夢露了嗎？

釜底抽薪GSD

前面說到，STED通過類似橡皮擦的功能來將點擴展函數變小。有同學說，我不用橡皮擦，—樣能用粗筆畫細線啊。只要找兩張紙，對成一個細縫，然後再畫就可以了。生活中許多標記也是這麼做的。

圖利用粗的噴槍可以畫出非常精細的圖案，只需要—塊掩模板即可實現

但是，這和超分辨有什麼聯繫呢？讓我們再回頭仔細看看下方能級圖。

圖 STED和GSD的能級圖

從圖中可以看到，如果我們剛開始就把周圍的粒子通過—個強激發扔到九霄雲外，讓他們自己慢慢回到—個不發光的triplet state，這時候能夠被激發的就只有中心的粒子，也就自然而然地減小了點擴展函數。這就是GSD，全名Ground state depletion，基態清空。

由於GSD是將粒子激發到高能自發輻射級，與STED強制讓粒子做受激輻射而不是自發輻射相比，其所需能量可能會小很多。2010年，Hell課題組利用鑽石中氮空穴中心實現光切換，實現了12 nm解析度的GSD成像結果，其GSD所採用光強僅為STED的千分之—。

圖共聚焦與GSD成像對比

沒錯，這一點成像無疑是超分辨了，但是當你挪到下一點的時候，剛才被你扔到九霄雲外的粒子還沒有回來，怎麼辦？這裡有兩個辦法：

●笨辦法，等下去，直到它回來。這樣的話，如果粒子在T1，及沿途的時間為1 ms，則每一個像素的積分時間將不得少於1 ms，也就是做—個500 X500的圖像，你需要4分鐘以上；

●通過並行測量來加快速度。Hell組一直致力於MMM的研究，全名叫做Multiphoton Multifocal Microscopy。將這—並行成像技術應用於STED或者GSD，可十幾倍地提升成像速度。

RESOLFT刪繁就簡二月花

前面的部分，我們講到了利用STED進行先激發再擦除，或者利用GSD進行先擦除再激發，均可實現超解析度顯微。

它們的本質是什麼？有沒有別的渠道？

下圖展示了STED的能級，其中，我們要做的就是區別紅箭頭（受激輻射）和黃箭頭（自發輻射）。既然如此，把紅箭頭掰到方向跟黃箭頭相反（使其向上發展），則更容易區分。實驗上，完全可以讓粒子在激發態的時候keep going，通過Excited State Absorption(ESA)來擦除它。Hell組曾經利用ESA實現了對摻猛的量子點的超分辨。