科普pcr的前世今生（神通廣大的數字PCR）

2023-10-14 00:13:56 4

什麼是數字PCR？

提起PCR，在生物及其相關行業內可謂無人不知無人不曉，半個世紀以來分子診斷的高速發展離不開分子生物學技術特別是PCR技術日新月異的進步。1983年由美國Mullis首先提出設想，1985年發明了聚合酶鏈反應，即簡易DNA擴增法，標誌著PCR技術的真正誕生。1999 年，美國學者 Kenneth Kinzler 與 Bert Vogelstein 首次提出了數字 PCR (digital PCR，dPCR)的概念，實現了核酸拷貝數絕對定量的突破，成為一種全新的核酸檢測方法，與傳統PCR技術相比，具有高靈敏度、高精準度、高耐受性和絕對定量的優點。那麼這項技術究竟有何神通之處？有哪些廣闊的應用前景呢？

一、基礎研究篇

1. 基因表達差異研究

數字PCR由於檢測時完全不依賴傳統的Ct值即可實現真正意義上的絕對定量，因而可以提供比實時螢光定量PCR更精確的基因差異表達研究，尤其對於那些靶基因表達差異微小的情況，如：mRNA、microRNA、lncRNAs等的表達分析；等位基因的不平衡表達；單細胞基因表達分析；外泌體核酸分子定量分析等。

2. 拷貝數變異（CNV）研究

微滴化的樣品處理及檢測，這種擺脫Ct值的計算方法而直接獲取目標基因的絕對拷貝數，為拷貝數變異的研究提供了絕對的檢測精度。是其他諸如二代測序、晶片雜交等平臺無法達到的。採用數字PCR能夠有效對二代測序（NGS）和微陣列比較基因組雜交（aCGH）等實驗結果進行驗證，並具有檢測周期短、成本低、樣本通量高等特點。

3. 低豐度DNA模板分子的精確定量

由於絕大部分微液滴中只含單個或不含模板分子，使得低豐度DNA模板分子的擴增不受高豐度模板分子擴增的競爭抑制：與此同時，樣品中可能存在的抑制劑也在分配到微液滴的過程中進行了相對稀釋，作用於單個微液滴內模板擴增的抑制劑數量大幅降低，從而提高PCR擴增對抑制劑的耐受程度，因此可應用於諸多臨床樣品（如血液、尿液、糞便、痰液、胸腹水、腦脊液等）中痕量核酸標記物的檢測。一般而言，毛細管電泳和定量PCR的檢測靈敏度約在10%，NGS的靈敏度可達到1%，而數字PCR的檢測下限可輕鬆實現0.001%。

4. 甲基化含量鑑定

作為表觀遺傳學研究中重要的一個研究方向——甲基化程度分析，現階段有不同的方法或技術來進行研究：如傳統的亞硫酸氫鹽處理後的克隆測序法、抗體檢測法、定量PCR檢測法等受限於方法學的問題，不能獲得甲基化程度的精確定量，而數字PCR系統通過對樣品的微液滴處理及目標分子的絕對拷貝數定量，為甲基化程度的精確定量檢測提供了一種可靠的技術。

5. 二代測序輔助建庫

目前靶向測序建庫方法包括擴增子方法，在均相溶液中，當擴增引物增加時，由於擴增引物之間的相互作用，從而影響擴增的效率；如果將其分散到大量微液滴中擴增，將可大大降低引物間相互作用，提高擴增效率。同時還可以實現對於少量模板的有效擴增，得到更多的有效測序數據。

6. CRISPR-Cas9基因編輯結果驗證

CRISPR-Cas9技術的發明，是基因編輯技術的一大突破，但如何驗證實驗是否成功，仍需要高靈敏度的檢測方法，數字PCR技術可以滿足這一需求。Broad研究所張鋒團隊發明了以CRISPR為基礎的SHERLOCK技術可以對核酸進行高靈敏度的定性檢測，但精確定量評估時仍採取了數字PCR進行確認。

二、疾病研究篇

7. 腫瘤的液體活檢

腫瘤學研究是數字PCR的重要應用領域，該技術作為極為重要的工具，能夠識別DNA突變（例如EGFR）、腫瘤患者用藥監控、基因擴增檢測、循環腫瘤細胞（CTC）特性研究、長鏈非編碼RNA檢測、液體活檢中循環的核酸（cfDNA）和腫瘤細胞（CTC）的絕對定量等研究中。

癌症標誌物稀有突變檢測

在一份給定的樣本中，相比於野生型DNA，癌症相關的突變序列比例較低，經常無法檢測。而憑藉其超高靈敏度，dPCR系統可以很容易地定量分析低至0.001%-0.0001%的突變頻率。之前用任何方法都無法實現準確穩定檢測的樣本，現在可以使用dPCR輕鬆進行定量分析。例如，已實現肺癌相關的表皮生長因子受體（EGFR）中T790M突變的檢測，可以更好地評估抗酪氨酸激酶抑制劑的治療。

腫瘤治療的伴隨診斷

常用體液來源（如血液，胸腹水，唾液及尿液等）的待檢標本中的DNA，有正常脫落體細胞和病變脫落細胞兩種來源，前者的量遠大於後者。通過微液滴處理能在每個微液滴中有效減少正常體細胞DNA的幹擾，實現腫瘤標記物的有效檢測，如EGFR，ALK，ROS1，KRAS、BRAF等基因的突變檢測、乳腺癌/胃癌的HER2基因擴增檢測等，應用於腫瘤精準醫學的伴隨診斷。

腫瘤治療的實時監控

已有數篇文章報導了使用數字PCR技術對患者治療過程中的循環腫瘤DNA（ctDNA）進行檢測，實時監控疾病進展。在非小細胞肺癌、乳腺癌和腸癌等多種腫瘤患者中都取得了令人鼓舞的結果。與影像學及其他常規指標相比，ctDNA突變及豐度改變通常會提前數月出現，這樣就可以提醒醫生及時調整治療方案，使患者得到更有效的治療。

8. 糖尿病

數字PCR技術目前在糖尿病中的研究熱點，通過定量檢測非甲基化DNA的水平，對I型糖尿病β細胞死亡進行定量，從而監控病情發展。

9. 無創產前篩查

無創傷的產前診斷, 如21號染色體為3倍體的唐氏症候群、已知父母基因型的胎兒地中海貧血或胎兒遺傳性耳聾基因檢測等。目前無創檢測標本來源主要為孕婦血液，而待檢測的胎兒DNA受到母體DNA的幹擾，影響了檢測的準確性。數字PCR技術可以作為二代測序法的補充來進行無創傷產前診斷，從而提高工作效率、降低檢測成本。

10. 致病微生物（病毒、細菌等）的檢測

疾病預防控制中心、出入境檢驗檢疫局系統的實驗室可以將基於TaqMan探針法的定量PCR體系無縫地轉移到數字PCR上，從而滿足該類實驗室對於檢測結果的要求：靈敏度更高、重複性更好、無需依賴標準曲線的絕對定量結果，同時操作簡便。

11. 肥胖

數字PCR技術能夠檢測到引起肥胖的重要因素之一AMY1（唾液澱粉酶）的基因拷貝數。

12. 傳染性疾病

數字PCR技術因起高精密度、耐受能力強、高靈敏度等優點，逐漸被用於病毒載量分析的相關研究。如HIV抗逆轉錄病毒治療過程中病毒殘留量的監控；HBV耐藥突變的檢測；HCV的分子分型；抗甲氧西林金黃色葡萄球菌的院內感染監控；環境微生物不同功能基因之間的連鎖分析等等。

13. 移植排斥監控中的應用

為了降低器官移植中移植物排斥導致的風險，數字PCR技術通過監測受體中移植器官供體的循環DNA水平來檢測早期移植排斥。

14. 腸道菌群分析

數字PCR技術直接計算目的序列的拷貝數，對樣品中的微生物實現了絕對定量，可用於微生物檢測，以便進一步研究腸道菌群的結構、功能以及數量。

三、其他領域篇

15. 轉基因食品或成分的檢測

目前在確定轉基因作物或成分的含量時採取定量PCR的標準曲線法，這種方法需要依賴於已知濃度的標準品(Certified Reference Materials Calibrants, CRMCs)。ddPCR絕對定量的方式可以徹底解決這些標準物質的定標工作，從而確保安全和品質。

16. 環境監測

基因目標的環境監測，需要對複雜樣品中低濃度的目標進行準確檢測。ddPCR每次運行中能創建數千個PCR反應室，帶來了目標的準確測定，即使它們濃度很低，因此可以實現對土壤、汙水、淤泥、酒泥等為樣本的環境生物學研究和病原微生物監測。

17. 基因型鑑定

PCR也可以用於檢測一個生物中是否存在某特定DNA序列，這被稱為基因型鑑定。例如，基因型鑑定可通過發現樣品中是否存在某種群特異性序列來判斷樣本的真實性。基因型鑑定還可用於法醫分析判斷在現場發現的DNA樣品是否和嫌疑人的吻合，令兇手無處遁形。

18. 早期精準檢驗疫情

2016年，全球首例數字PCR動物疫病檢測試劑研發成功，包括禽流感、禽流感H7N9、藍耳病、高致病性美州株、豬的流行性腹瀉等動物疫病檢測試劑盒。此項技術的推出，將有助於在食品安全的源頭及早發現疫情，儘早處理避免更大面積的傳染，更好地控制漏檢，減少傳染人的機率；也將有助於國家建立規範化、規模化的動物疫病新型檢測方法。

19. 藥物基因組檢測

能夠通過PCR技術實現藥物基因組的檢測，提高合理用藥水平，具有通量較高，操作簡單，儀器設備易普及等優點。

番外

數字PCR冷知識：胎兒性別不是只有B超可以看出來，一隻精通數字PCR的科研狗，也可以測出來。

綜上，數字PCR技術影響之深、應用之廣可見一斑，如今，科學界對於數據準確性和結果可靠性的要求越來越高，更多的實驗室將目光轉向擁有絕對定量方式、高靈敏度和高重複性特質的數字PCR技術。數字PCR是目前非常重要的核酸分子診斷技術之一，可以說是未來臨床分子診斷的關鍵平臺。隨著其應用領域的不斷延伸，我們有理由期待數字PCR技術在經歷過逐步發展和自我完善後，發揮巨大潛力，成為新一代分子診斷的標準工具。