神經恢復有必要一直針灸嗎（神經元再生療法誕生始末）

2023-10-13 06:35:01

圖片截自michaeljfox.org

引 言

2020年4月8日《細胞》雜誌、2020年6月24日《自然》雜誌分別在線發表了上海神科所研究員楊輝團隊和加州大學聖地牙哥分校教授付向東的論文：兩篇論文用不同的手法敲低同一個分子（PTBP1），成功在小鼠腦內將膠質細胞轉化為有功能的神經元—— 這對 「再生療法」 用於治療神經退行性疾病是一個重要的裡程碑進展。2020年7月2日，付向東實名舉報楊輝涉嫌剽竊其工作以及造假等學術道德不端行為的舉報信在知乎等網絡平臺得到廣泛傳播，其中提到他為鑑定證明PTBP1的作用投入了9年多的時間和工作，包括 6 年的實驗工作，以及近 3 年審稿過程中的補充實驗工作。

那麼，這一過程是什麼樣的呢？本文基於6月24日對付向東及其實驗室博後錢浩博士的採訪，對他們圍繞PTBP1所做的科學探索之路進行了梳理。

撰文 | 黃宇翔

責編 | 葉水送

2009年年底。

看著顯微鏡下海拉細胞表面長出的枝丫，正在為博士後出國訓練做準備的薛願超感到十分不解。

海拉細胞是一類表皮細胞，在1951年由約翰霍普金斯醫學院的研究者從一位名叫海莉·拉克斯的子宮頸癌患者中分離培養出的永生細胞系。在半個多世紀的時間裡，海拉細胞在條件適宜的環境下平均每22小時數量翻倍一次，產生的新細胞的形態也與上一代高度相同：憑藉著像梭子一樣扁平化的細胞結構，它們能緊貼在培養皿中底部旺盛生長，那由磷脂雙分子層構成的細胞邊緣十分平整，給人一種流線型設計的美感。

全世界各個實驗室儲存的海拉細胞數以億計，大都保持著和半個多世紀以前那批子宮頸癌細胞幾乎一致的形態。

但展現在薛願超眼前的這盤海拉細胞，卻在原本平滑的表面上多出了許多的分叉。這就好像是在斑馬頭上長出鹿角之類的配件一樣詭異。他清晰地記得當時的情況，大約兩周前他把這盤細胞放進恆溫培養箱，細胞的表面絕對不是這樣的。這個培養皿中的細胞原本應長得和其他億萬個海拉細胞一樣，梭子狀輪廓的邊緣十分光滑。

薛願超不禁開始思考：在過去兩周的時間裡，這些細胞內部究竟發生了怎樣的變化？

這些海拉細胞系的特別之處，是薛願超在它的基因組中插入了一段轉基因序列，使得其可以表達一小段 RNA 序列。這個精心設計的 RNA 就像是一顆 「定時炸彈」，可以基於鹼基互補配對選擇性地與細胞中一個名為 PTB 基因的 RNA 結合—— 一旦結合，便會引爆，吸引細胞內的 RNA 降解蛋白將 PTB 基因的 RNA 清除，沒了 PTB 基因的 RNA，細胞自然也無法再大量合成出 PTB 蛋白。

生物學家研究一個問題，通常會從充分性和必要性兩個角度進行研究。充分性往往是在一個系統中人為增加一些東西，看看會引起哪些變化；必要性則是去人為地減去系統中的某些成分，其中最常用的手段就是通過基因編輯或者 RNA幹擾的 「定時炸彈」，精確地下調某一個基因產物的水平。

薛願超為什麼想要下調海拉細胞中的 PTB 蛋白量呢？我們後面會提到。

聽了學生匯報海拉細胞長出奇怪枝丫的觀察，加州大學聖地牙哥分校教授付向東內心忽地划過一道閃電，意識到這背後很可能隱藏著一個重要的科學發現。斑馬的頭上長角很奇怪，但是如果這對角長在鹿的頭上，就不會讓人感到奇怪。這種枝丫的結構，在表皮細胞中稀奇，但是神經細胞中卻非常普遍。在海拉細胞中敲低 PTB 蛋白，會不會像是對斑馬施展了一道神奇魔法，讓它頭上長出鹿角了呢？

這是付向東的直覺思維，接下來他想到了近期分子神經生物學領域的幾個最新研究：

第一，PTB 蛋白在動物細胞中還有兩個高度相似的 「兄弟姐妹」，其中之一就是 nPTB：它們的 DNA 序列高度保守，不同之處在於 PTB 在幾乎所有的細胞中都大量表達，而 nPTB 僅僅局限在神經細胞中表達（nPTB名字中的n的意思就是neuronal，即神經的）；[1,2]

第二，nPTB 的蛋白與許多參與神經發育的因子有關聯，nPTB 可能是一個觸發細胞向神經元分化的 「開關」；

第三，PTB 會負向調節 nPTB 蛋白產物的表達量：至少在當時已經發現PTB的蛋白產物可以結合 nPTB 的 RNA，通過促進 nPTB 的 RNA 的降解，下調細胞中 nPTB 的蛋白量。

基於此，付向東覺得這個奇怪的發現很有意思，他建議薛願超追著這條線索往下繼續偵察下去。

於是，一段奇妙的科學探險就此拉開帷幕。而此前付向東作為一名分子生物學家，研究 RNA 研究將近四十年，這是他了解 RNA 剪切、PTB 以及神經再生療法的關鍵。

自從1983年付向東通過中美生物化學聯合招生項目（CUSBEA）來到美國凱斯西儲大學，師從 Jonathan Leis 研究鳥類逆轉錄病毒的增殖調節開始，RNA 就成了他科學生涯的核心。

RNA 全稱核糖核酸，在維持細胞正常功能中扮演重要角色：它們在細胞核內以 DNA 為模板轉錄產生，然後在細胞質中發揮多種多樣的作用。正因為其功能對於細胞的生存異常重要，細胞演化出了一系列能夠調節 RNA 序列組成和穩定性的精密機制。但如果某個基因的 RNA 數目超出了細胞的需求，細胞還會啟動一套特殊的 RNA 降解分子機器，通過主動清除冗餘的 RNA，保證細胞內 RNA 水平剛好能夠滿足細胞需求。這套被稱作 「RNA幹擾」 的分子機制的發現，2006年得到了諾貝爾生理學或醫學獎的認可。

在這一領域，付向東於1990年代鑑定出的 RNA 剪切因子 SC35、第一個 RNA 剪切因子激酶，推進了人們從分子生物學層面對RNA剪切過程的認識。

然而，21世紀初的國內學術界，RNA 生物學的研究水平與國際頂尖力量有不小的差距。因此，接到昔日同窗、武大生科院負責人發出的回母校——武漢大學任教的邀請時，付向東覺得這是一個領導推動國內 RNA 生物學領域前進的良機。

付向東選擇了兼職，成為武大的諮詢顧問，與武大教授張翼共同指導研究生。回到武漢大學，他不但能有機會多看望居住國內的父母，還能帶動國內一個領域的發展，這無疑是促使付向東作出回國決定的兩個重要考慮因素。此外，受益於 CUSBEA 項目培養，他亦將推動國內生物學研究生教育視為自己的一份責任。

在2004年入學的博士研究生招生過程中，一位姓薛的年輕人引起了付向東的注意。在眾多嚮往武漢大學生命科學學院博士研究生的申請者中，本科畢業於信陽師範學院的薛願超的簡歷並不耀眼，但付向東並沒有將本科學習成績當作招收研究生的唯一評判標準：他給申請者們發了一篇近期發表的Science論文，要求大家寫下讀後的感想。

在交上來的作業中，有一份特別的閱讀報告，對問題的思考很有深度，一下子吸引了付向東的注意。薛願超如願被武漢大學錄取，在張翼和付向東的聯合指導下攻讀博士學位。

在薛願超加入付向東和張翼的聯合團隊時，RNA生物學領域的科學家們已對 RNA 結合蛋白產生了濃厚的興趣：在當時，已經有不少證據提示 RNA 結合蛋白的功能和神經性疾病、自身免疫病存在密切聯繫。但在分子機制水平，這些 RNA 結合蛋白究竟靶向哪些特殊的 RNA 分子仍然存有巨大的謎團。付向東和張翼也躍躍欲試，帶領團隊加入搜索 RNA 結合蛋白靶點的尋寶大軍中。

相比於 DNA，RNA 有更豐富的二級結構，且更不穩定，這增加了研究 RNA 結合蛋白靶點的難度。2003年，洛克菲勒大學 Robert Darnell 在方法學上發明的 CLIP 技術，為人們尋找 RNA 結合蛋白所結合的 RNA 分子鋪平了道路。CLIP 新技術對於想要深入研究 RNA 結合蛋白的付向東而言，如同一柄削鐵如泥的寶劍。

付向東先按照 Robert Darnell《科學》論文中公布的配方，在自己的實驗室照葫蘆畫瓢，鍛造出一把鋒利的仿製品，並將這項 「打鐵」 的任務交給了動手能力極強的薛願超來做。寶劍出鞘，該使出怎樣的劍招呢？他們需要確定運用 CLIP 技術研究的對象。

在細胞內數量眾多的 RNA 結合蛋白當中，他們將目光聚焦到了一個名為 PTB 的蛋白身上。

PTB全稱多聚嘧啶區結合蛋白（polypyrimidine tract-binding protein），得名的原因來自最初克隆它的 Philip Sharp 教授團隊觀察到其能結合富含嘧啶的鹼基序列。Sharp 團隊最初推測其是一個能直接介導 RNA 剪切因子（splicing factor），但後來其他團隊的工作表明 PTB 其實是一個參與調節 RNA 剪切反應抑制性因子（splicing repressor）。付向東很擅長 RNA 剪切領域的研究，再加上實驗室中正好有高度特異性的 PTB 抗體可用，他們就決定將 CLIP 技術首先應用於 PTB 靶點 RNA 的搜尋。[4-6]

薛願超博士五年工作的關鍵成果，就是在全基因組水平鑑定了HeLa人細胞系內可能與 PTB 蛋白結合的 RNA，該發現於2009年發表於《分子細胞》雜誌。PTB 蛋白家族包含了三個成員：除了在大部分體細胞中都廣泛表達的 PTB 之外，還有局限於神經細胞中表達的 nPTB 和在免疫細胞中選擇性表達的 ROD1。因此，在推進 PTB 課題的同時，薛願超也利用 CLIP 技術在尋找 nPTB 作用的 RNA 序列。

然而，相比於 PTB，nPTB 結合靶點課題就好像是一份在地下埋藏得更深的寶藏，這主要因為不同於普遍表達的 PTB，nPTB 局限於神經細胞中表達，而且僅僅在神經元發育的早期表達。就像是捕魚，PTB 蛋白在各個池塘中都有，且全天候活動；而 nPTB 只在神經細胞這片 「池塘」 中存在，且在特定的一小段時間內拋頭露面，這無疑增加了垂釣者的難度。探索 nPTB 蛋白結合的RNA 靶點，如果僅僅直接照搬《分子細胞》論文中的方法，還行不通。

薛願超需要對實驗條件進行優化。2007年，UCLA 的 Douglas Black 團隊發現，PTB 蛋白能夠結合在 nPTB RNA的內含子區以調節剪切位點的利用，導致 nPTB 轉錄本的第十個外顯子在 RNA 剪切加工過程中被跳過，使得其在細胞中被快速降解，抑制細胞中 nPTB 蛋白含量。[1]

如果把 PTB 和 nPTB 想像成兩條魚，假設前者會以後者為食進行捕捉，致使後者大部分時間都躲在暗處，只有在一部分 PTB 水平較低的細胞中，nPTB 才會選擇在特定的時間段露面。

要想運用 CLIP 技術尋找 nPTB 的結合靶點序列，需要讓 nPTB 蛋白在胞內穩定地達到足夠高的濃度。於是很自然地讀者通常能想到的第一個法子是在細胞系中對 nPTB 進行過量表達，但在此處由於 PTB 是在 RNA 水平抑制 nPTB 的表達，那麼即使表達了更多的 nPTB，PTB 也會兵來將擋，細胞中依然沒有足夠多的 nPTB。

於是，薛願超想到了第二個辦法：他決定使用RNA幹擾技術，對細胞內的 PTB 蛋白進行下調。他的思路是，如果平日 「欺壓」 nPTB 的 PTB 被他剷除了，nPTB 蛋白就敢冒出頭來。一旦 nPTB 蛋白在細胞中穩定存在，那麼他就能利用 CLIP 技術在全基因組範圍內尋找 nPTB 的 RNA 靶點。

他設計了一個 shRNA 質粒，使得其在插入海拉細胞基因組後能穩定大量表達靶向 PTB 的 「定時炸彈」。這就是開頭中出現的那個長出枝丫的奇怪細胞系。

付向東和薛願超都對這個意外的發現感到十分驚奇。於是在博士畢業後，薛願超決定到付向東位於聖地牙哥的實驗室，在博後階段繼續探索 PTB 敲低的海拉細胞中長出枝丫的神秘原因。

來到聖地牙哥以後，薛願超首先在多個不同的細胞系中通過 RNA 幹擾技術穩定敲低 PTB 表達量—— 多個細胞系均出現了枝丫狀的輪廓，肯定了他此前的觀察不是一個偶然的特例。新轉化形成的細胞的基因表達也發生了變化，許多在神經細胞中特異性表達基因的表達量在 PTB 下調之後也顯著增加了。

更讓他感到高興的是，在小鼠胚胎成纖維細胞（MEF）中敲低 PTB，細胞不僅在形態上長得更像神經細胞了，而且進一步電生理實驗結果表明，新轉化得到的細胞在功能上表現出與神經細胞相似的特性—— 可以產生動作電位（action potential）。這些結果都提示，降低細胞中 PTB 蛋白表達量，能誘導成纖維細胞分化為一類近似於神經細胞的細胞類型，說明在細胞命運決定的過程中，PTB 可能是一個阻斷細胞向神經細胞轉化的「路障」。

但作為一個調控 RNA 剪切過程的蛋白，PTB 是如何影響細胞命運的決定呢？付向東和薛願超需要在機制上為自己的發現找到一個合理的解釋。

他們推測，PTB 誘導細胞向類似於神經細胞方向分化，可能是通過 RNA 剪切調節了與神經細胞分化相關的轉錄因子。在當時已經報導的一打的誘導神經細胞發育的轉錄因子當中，一個名為 REST 的蛋白吸引了他們的注意力：

第一，REST 蛋白顧名思義，是讓細胞維持在一種 「休息」 的狀態，是一道阻止細胞向神經元分化的屏障。

第二，REST蛋白已經被發現存在不同的同源異構體（splicing isoform），即REST基因的成熟mRNA中存在多種外顯子的組合方式。這意味著REST的表達量很可能在RNA剪切過程中經歷了關鍵的調節。

第三，已知REST蛋白在被miR-124特異性結合後會快速降解。

經過嚴謹的細胞生物學實驗，付向東和薛願超最終證明 PTB 也能結合 REST及其複合物中多個關鍵組份，從而阻止其經歷 miR-124 介導的降解，使得細胞中 REST 轉錄因子維持在較高的水平，於是細胞難以向神經細胞方向轉化。這項發現最終被發表於2013年的《細胞》雜誌，引起了業內廣泛的關注。[8]

這是因為如果真的通過調節一個 RNA 結合蛋白就能誘導產生新的神經元，那麼在眾多因為神經元死亡而導致的神經退行性疾病中，都有可能通過阻斷 PTB 通路誘導產生新的神經元作為治療的手段。PTB 在神經細胞命運決定中的作用為神經退行性疾病的 「再生療法」 帶來了新的曙光。

付向東的團隊以分子生物學手段見長，但對於神經生物學實驗的經驗並不多。因此，儘管早在2011年他們就已經開始嘗試在體內通過下調 PTB 誘導產生新的神經元，但進展卻比較慢。

PTB介導的神經元轉分化通路模型[9]

就在同一年，中科院生物物理所神經生物學家王晉輝培養出的一位優秀博士研究生錢浩加入了付向東的團隊，挑起了實驗室神經生物學實驗的大梁。那麼，基於 PTB 的再生療法能成為治療神經退行性疾病的 「天降神兵」，還是說一切到頭來只是竹籃打水一場空？

2013年，RNA 結合蛋白 PTB 控制神經細胞命運決定的發現，燃起了人們對於神經退行性疾病再生療法的熱情和期待。但從基礎研究走向臨床的道路有太多的阻礙，這篇論文的發表僅僅是萬裡長徵的第一步。

付向東和薛願超對於這一點心知肚明。首先擺在他們眼前的問題，是搞清楚人和小鼠細胞命運決定通路之間的差異。他們發現，儘管小鼠成纖維細胞在敲低 PTB 後可以分化成在形態上與功能上都類似於神經細胞的類型，但人的成纖維細胞在同樣敲低 PTB 之後卻僅僅在形態上 「形似」，卻不具有神經細胞所具備的諸多電生理學性質。

在體外得到的神經細胞僅僅 「形似」 而 「神不似」，空長了一副接近神經細胞的皮囊，卻沒有神經細胞的功能—— 如果在這種情況下貿然直接進行體內實驗，縱使誘導出了大量形似神經的細胞，由於缺乏功能，對於疾病的幫助可能也極為有限。

因此，他們的當務之急是找出為什麼敲低 PTB 在小鼠中可以得到具有功能的神經細胞，而在人的成纖維細胞中卻只能產生出一堆無功能的細胞。這個問題就像是懸在付向東和薛願超頭頂的達摩克利斯之劍。

在人成年成纖維細胞中，敲低 PTB 能引起 nPTB 產生，細胞呈現出類似於神經細胞的外觀，表明很可能已經誘導向神經細胞方向分化，但在中間停了下來。如果將人成纖維細胞向神經細胞分化的過程想成是一塊巨石從山坡滾到山腳的過程，那麼敲低 PTB 在外觀形態學上引起的改變可能已經 「推動」 了巨石向下的運動，但在到達半山腰的某處卻因為有障礙物而被攔了下來。這個 「路障」 在小鼠中阻力較小，因此決定細胞命運的巨石憑藉自身強大的慣性得以平穩通過；但在人成纖維細胞中內在的阻力較大。

付向東和薛願超設想，如果能找到擋道的 「路障」，將其清除以後，人細胞命運的巨石就也能有始有終，最終分化為形態與功能兼具的神經細胞。他們將從山頂到半山腰的細胞命運決定過程稱作 「神經誘導」（neural induction），將半山腰攔路石與山腳之間的部分稱作 「神經成熟」（neuronal maturation）。這就是 PTB 介導的神經細胞分化的 「兩步走模型」（2-step model）。

那麼，人成纖維細胞中的半山腰處的這塊 「攔路石」 究竟是什麼？為了研究這塊 「攔路石」，付向東和薛願超採取了一個巧妙的思路：已知轉錄因子在神經細胞分化中扮演著類似於 「鑰匙」 的重要作用，並且研究者也已經報導了一系列這樣的轉錄因子。那麼 PTB 下調也應該是通過一些神經細胞發育相關的轉錄因子幫助細胞順利通過半山腰的攔路石。只要找出移除這些障礙的轉錄因子，就距離目標更近了一步。

2016年，他們終於篩選到了一個關鍵的轉錄因子—— BRN2。這個發現於2016年發表在《自然神經科學》。[10] 但更讓付向東團隊興奮的，是來自於錢浩在星形膠質細胞體外培養實驗中所作出的觀察。

星形細胞是在成熟大腦內大量存在的一類膠質細胞。不同於已經停止分裂的神經細胞，星形細胞在接收到生長信號後依然能快速複製增殖。因此，試圖將星形細胞轉變為神經細胞，是神經退行性疾病再生療法中最具有潛力的策略之一。

就在薛願超開展尋找 BRN2 實驗的同時，錢浩在薛願超和胡婧提供的分子生物學技術支持下，通過 RNA 幹擾技術敲低體外培養的星形細胞中的 PTB 表達量，發現體外培養下的星形細胞可以轉化為在形態、基因表達和電生理性質都接近於神經細胞的細胞類型。

原來，在星形細胞中，BRN2 始終處於較活躍的狀態。換句話說，由於 BRN2 一直存在，星形細胞向神經細胞分化的半山腰上的 「攔路石」 攔不住分化的勢頭了。這真是實在是天公作美，錢浩立刻開展體內了實驗，探究 PTB 敲低在生理學環境下的影響。

但付向東和錢浩在開展體內實驗時，對於實驗結果並不樂觀。此前也有一些實驗室報導可以通過控制特定轉錄因子的表達能夠在體外誘導產生神經元，但是這些靶點一旦到了環境更為複雜的體內，卻紛紛失靈。[11-13]

生物醫學的研究有的時候真的就像是魔法，雖然中間還有許多未解的黑箱，其中任何一個環節出錯都會讓整套實驗的希望化為泡影。但也有少數的實驗，聽上去困難重重，但竟然真的能夠像走鋼絲一樣不出差錯地收穫成功。

錢浩的體內實驗很快取得了進展。他向中腦區域注射能敲低 PTB 水平的 AAV 病毒，中腦中一部分星形細胞形態變化為神經細胞的樣子，表達出神經細胞特有的基因，獲得了神經細胞特有的電生理性質，並且伸出長長的軸突直達紋狀體。

此外，他還向帕金森模型小鼠的中腦區域注射 AAV 病毒敲低 PTB，小鼠運動能力顯著恢復，提示新轉化出的神經元具有參與運動控制的功能。

反義寡核苷酸是目前比較接近臨床應用的基因治療手段，已經有治療神經系統疾病的 ASO 藥物在國內外獲批上市。為了向臨床方向努力，錢浩化學合成了靶向 PTB 的 ASO 藥物，注射入帕金森模型小鼠體內，小鼠運動能力得到修復，概念驗證性實驗結果喜人。

2017年12月，付向東將這些結果整理成文，投到了《科學》雜誌。這些結果如果能得到更多團隊獨立的驗證，無疑將會成為神經疾病再生療法的重要裡程碑。付向東抑制不住內心激動的心情，甚至在投稿到《科學》之前，就已經開始在一些學術研討會和會議報告中與同行分享這奇妙發現的喜悅。這些結果看上去如此完美，究竟是真是假？

科學家偶爾會被自身的狂熱衝昏頭腦，由於不識廬山真面目，對實驗數據進行過度的解讀。因此，學術共同體遏止這種 「科研大躍進」 的一個關鍵措施就是 「同行評議」 制度，如同一臺X光照相機一樣對論文的邏輯漏洞逐一檢查。論文的作者只有對審稿人提出的問題進行合理的回答，雜誌的編輯才會最終接受、發表論文。

付向東關於靶向 PTB 蛋白進行神經細胞再生療法的論文看上去過於完美（too good to be true）。對於這個發現，雜誌編輯和審稿人有責任用苛刻的眼光對文中的結論進行檢驗。這種檢驗儘管有時候會被認為是 「雞蛋裡挑骨頭」，大大放慢了科學論文發表的速度。

在綜合了幾位審稿人的意見後，《科學》雜誌的編輯，覺得儘管這項工作意義重大，但是仍然對實驗的可重複性十分擔憂，因此拒收這篇論文。儘管遭到了《科學》雜誌的拒稿，付向東和錢浩依然得到了很多建設性的建議。經過一些修改，他們於2018年11月將工作投稿到了《自然》雜誌。

付向東提交給《自然》的論文草稿吸引了編輯們濃厚的興趣—— 毫無疑問，如果付向東的這個發現能被其他團隊穩定重複，絕對會是一個裡程碑式的突破。但越是重量級的成果，越需要小心謹慎。《自然》對付向東的這篇投稿非常重視，邀請了四位審稿人進行同行評議。審稿人無一例外的對這項工作的重要意義給予了充分的肯定，但同時也就其中包含的漏洞提出了許多建設性的意見。

《自然》雜誌的編輯在發給付向東的郵件中說，只要他們能合理地就審稿人們提出的問題給予合理的答覆，《自然》一定會發表這項工作。他們不用擔心被其他團隊搶發的風險，因此有充足的時間可以安心地將文章的關鍵結論做得儘可能紮實。

在審稿人圍繞論文結論提出的眾多問題中，最關鍵的問題有三個：

第一，基於付向東團隊所展示的數據，他們無法說明在帕金森模型小鼠中，是新轉化產生的神經元直接導致行動能力的恢復。因為他們的實驗結果只能說明在中腦注射 AAV 病毒敲低 PTB，能觀察到行為能力的恢復——對於這一結果還存在另一種可能的解釋，即感染鼠腦的 AAV 病毒通過影響其他本來存在的神經元的狀態恢復運動能力。

第二，付向東的投稿中對於新轉化產生的神經元具有完整功能的證據尚不十分充分。付向東觀察到由中腦星形細胞轉化形成的神經元可以將突觸投射到紋狀體核團，但這僅僅是結構角度的證據。審稿人認為要想坐實關於由轉化產生新神經元具有功能的結論，需要在對這部分神經元進行刺激後，在紋狀體區域記錄到真實的神經遞質釋放。

第三，小鼠和人的大部分神經退行性疾病有更大的概率發生在年老體衰之時，而細胞的分化能力會隨年齡的增加而逐步降低。投稿中付向東展示的實驗主要為年輕鼠的數據，而神經元再生療法成立的一個重要基石是在年老人群中也可以誘導產生新的神經細胞。因此，審稿人認為付向東至少應該在年老小鼠中檢驗轉分化策略的治療效果。

這三個問題都問得一針見血，再加上編輯們作出的不擔心被搶發的保證，付向東和錢浩打算靜下心來慢慢打磨這篇文章，在把審稿人要求的主要實驗都完成後再將論文投回到《自然》。相比於急著發表出來彰顯自己的成果，精益求精地把結論做到儘可能的紮實完整會更有意義。

仔細閱讀審稿人的反饋意見之後，錢浩和付向東一起討論應對三個核心問題的對策：

對於問題一，他們設計了一個基於化學遺傳學的精巧實驗：在裝載了表達 shPTB 的 AAV 病毒載體上，他們利用分子生物學同時表達了一個人工改造的G蛋白偶聯受體（G-protein coupled receptor(GPCR)）—— Gi-DREADD，這個特殊的G蛋白偶聯受體一旦表達在細胞膜上，就會在人工注射藥物 CNO 時被激活，導致細胞變得更加難以被激活。

於是，他們根據此前的實驗條件誘導星形細胞轉化為神經細胞，並使得這些轉分化的神經細胞表達化學遺傳學受體。他們首先觀察到帕金森模型小鼠的異常行為因為這些轉分化神經元的作用而得到恢復；隨後再用配體藥物 CNO 激活這些受體，轉分化的神經元的功能被抑制，而異常行為則再次出現；最後隨著配體逐漸被代謝，轉分化神經元的功能又得到恢復，而異常行為也同步改善。由於這些化學遺傳學受體只表達在轉分化神經元上，而與其他細胞無關，所以該實驗能有力證明動物行為改善是直接來自於新生的神經元。

對於問題二，如何能實時地記錄腦內的神經遞質釋放呢？當時，北京大學生命科學學院的 「探針王子」 李毓龍的 GRAB 探針系列還沒有正式發表，要想記錄中腦神經元投射到紋狀體區域的神經遞質多巴胺的釋放量，比較成熟的實驗技術是基於氧化還原原理的碳纖電極記錄法。付向東的團隊此前並沒有使用這一實驗方法的經驗，於是向北大分子醫學所的周專教授進行求助—— 周專團隊昔日的成員、已經在瀘州的西南醫科大學建立實驗室的康新江研究員此前關於記錄多巴胺釋放積累了豐富的經驗。於是康新江臨時回到在北京大學昔日工作的地方，在收到付向東從聖地牙哥寄來的小鼠後立刻開展實驗：他用一根電極刺激黑質紋狀體通路（預期激活那些由星形細胞轉分化形成的神經元），同時用另一根記錄電極在紋狀體區域（轉分化形成的新神經元投射到的腦區）進行記錄。

在這個實驗中，記錄電極在完整的腦區內能記錄到電刺激引起的多巴胺釋放，而在因帕金森模型誘導發生損傷的腦區所記錄到多巴胺釋放信號會顯著降低。如果在損傷的大腦中出現轉分化神經元後，能記錄到多巴胺信號的增強，就可以為轉分化神經元具有神經信號傳送功能提供強力的證據。

周專和付向東在這個合作中採取了雙盲的實驗設計：即康新江在記錄電刺激誘導的多巴胺釋放時，並不知道手中的樣品是否損傷、是否表達了轉分化神經元。康新江將數據整理後，與付向東手中的小鼠編號核對，這樣可以儘可能地減少主觀因素對實驗結果的影響。

實驗的結果十分清晰，完全符合實驗前的預期。審稿人的第二個問題由此迎刃而解。

第三個問題回答起來並不困難，只要在年老的小鼠中進行類似的實驗處理即可—— 錢浩此前的轉分化實驗主要使用的是兩個月大的小鼠，現在將其應用到年齡為一年大的小鼠身上。但這一回，實驗結果卻有點令人費解。

為了檢驗轉分化神經元對小鼠運動能力的恢復作用，錢浩使用了兩種不同的行為學實驗：此前在兩個月大的小鼠中轉分化神經元在兩種行為學實驗都能產生顯著的修復效果；但在一年大的小鼠中，兩個行為學實驗卻只有一個表現出修復效果，另一個和對照組沒有顯著的差異。

「對於這個結果的解釋需要格外謹慎，」 付向東表示，「我們認為這個結果表明轉分化神經元在一年大的帕金森模型小鼠的運動能力修復中能取得 『部分成功』（partial success），但目前我們還不能得出更明確的結論—— 這是一個既不能說 yes 也不能說 no 的實驗結果。」

錢浩和付向東投入更多的時間精力去確認這一結果的可重複性，並在重新投回到《自然》的稿件中將這部分數據附在了 「補充圖表」（extended figure）中，並表示這部分數據由於比較模糊，可能考慮會從論文中去除。

付向東與周專合作開展的激活-多巴胺釋放記錄實驗[9]

化學遺傳學實驗論證轉分化形成的新神經元直接導致運動能力的修復[9]

年老小鼠行為學實驗結果[9]

再次看到經過一年多時間打磨的論文後，審稿人們深深被論文紮實的論證折服，一致同意發表。其中一位審稿人還強烈建議付向東將年老小鼠的實驗結果放在主圖表（main figure）中—— 在他看來，這個結果非常有說服力。作為帕金森模型的專家，他認為在該行為學實驗中無顯著差異，而在另一個行為學實驗中表現出顯著修復效果，正是他所意料中的結果。因為有些行為學模型受年齡的影響，進而進一步支持付向東論文的結論，即通過敲低 PTB 誘導產生轉分化神經元在年老帕金森模型鼠中也能達到一定程度的修復效果。

正當萬事俱備，編輯準備正式接受付向東的文章之時，《細胞》在2020年4月8日在線發表了中科院神科所楊輝研究員利用 CRISPR 技術敲低 PTB 治療視網膜疾病的論文。[14]

看到自己的工作被同行 「搶發」，付向東不禁心中一涼。但很快《自然》的編輯為他吃下了一顆定心丸：原來，在2019年1月的時候，楊輝團隊的這篇論文首先投到了《自然》，並且被編輯交給了同一批審稿人進行同行評議。但幾位審稿人都認為楊輝團隊的論文儘管與付向東的論文有異曲同工之妙，但在數據的紮實程度方面略差一籌，最終將這篇論文拒絕。

「《自然》的編輯告訴我們，他們堅信在為發現優先權蓋棺定論時，論文提交的時間要比實際發表的時間更重要。而《自然》作為一家有著百年傳統的頂級科學期刊，與其搶在其他期刊之前發表重要的原創發現，更在意支撐論文結論的證據的可靠性。」

2020年6月25日，付向東的文章作為封面文章在《自然》亮相，在國內外學術界均引起了很大的關注。付向東表示，「我計劃將剩餘的科學生涯，完全投入到將分子生物學應用到神經退行性疾病的治療研究中。」

參考文獻

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12. Barker, R. A., Götz, M. & Parmar, M. New approaches for brain repair—from rescue to reprogramming. Nature 557, 329-334 (2018).

13. Cohen, D. E. & Melton, D. Turning straw into gold: directing cell fate for regenerative medicine. Nature Reviews Genetics 12, 243-252 (2011).

14. Zhou, H. et al. Glia-to-Neuron Conversion by CRISPR-CasRx Alleviates Symptoms of Neurological Disease in Mice. Cell (2020).