同源重組法原理（乾貨如此簡單的同源重組實驗）

2023-10-04 04:33:08 2

相信各位經常進行分子克隆實驗的小夥伴對載體構建實驗非常熟悉，通過這項實驗，我們能夠將自己期望的DNA片段組裝到目的質粒，隨後經過感受態細胞轉化等操作得到重組質粒。實現載體構建的技術方法有多種，如酶切連接法、Gateway克隆、同源重組克隆等，其中Vazyme同源重組方法以其簡單、快速且高效的特點，幫助了眾多小夥伴順利完成了載體構建實驗。但實驗的道路不總是一帆風順，也會碰到許多問題，其中最常見的是塗板不長克隆。

今天小V帶著大家一起探討這類問題的分析和優化策略，幫助大家在遇到時，能夠更好更快的找到原因併合理改進實驗。

首先，分析引物設計、線性化載體及目的片段

01引物設計

✦建議同源臂長度15-20bp（酶切位點序列不包含在內），GC含量40-60%，超出範圍會影響重組效率

以下圖為例解析單片端同源重組引物的設計原則：

載體pUC19，使用限制性內切酶EcoR I、Hind III雙酶切方式線性化

灰色框內序列組成：同源重組的同源臂 酶切位點

同源重組引物設計原則（如下圖所示）

✦推薦使用CE Design引物設計軟體，選擇對應模塊，按要求輸入序列完成引物設計

軟體可從下述幾種途徑獲取：

1.登錄Vazyme公司官網（http://www.vazyme.com），選擇生命科學→資源支持→常用工具→實驗工具→CE Design引物設計軟體

2.複製連結

https://crm.vazyme.com/cetool/singlefragment.html

02線性化載體和插入片段

線性化載體和插入片段的長度範圍及製備方式

✦插入片段和線性化載體，推薦使用切膠回收方式進行純化回收（切膠時間最好控制在3min內）。

✦使用Nanodrop/Onedrop等儀器檢測核酸濃度。若濃度小於20ng/μl，建議多做幾管，合併在同一管回收，提高濃度

註：通過凝膠電泳將片段條帶與DNA Marker條帶的亮度比對估算條帶濃度，若實驗室的核酸染料為EB染料，可以判斷；若為EB替代物，尤其Gelred等大分子核酸染料，不建議使用該方法。Gelred等大分子染料的濃度線性範圍和EB不同，對核酸濃度的解析度不高，不同濃度的核酸條帶亮度差不多。

其次，分析重組反應體系和操作

01重組反應體系

✦線性化載體和插入片段的使用量

線性化載體和插入片段的最適使用量計算及使用量範圍

註：線性化載體和插入片段的區分依靠長度判斷，長度最長的片段為線性化載體，其餘為插入片段；若計算得到的最適使用量超出對應使用量範圍，則使用對應範圍的極限值。

✦重組體系各組分的投入體積最好≥1μl

若投入體積10kb質粒轉化。

✦重組產物與感受態細胞用量

重組產物體積：感受態細胞體積=1：10，推薦10μl重組產物 100μl感受態細胞。

02塗板操作

✦抗生素抗性：平板使用抗性與轉化的載體抗性需保持一致。

✦菌液塗板體積：建議將菌液離心，移液槍吸取丟棄多餘LB培養基，保留100μl重懸，全部塗板。

如果屏幕前的你對於同源重組實驗還有問題，不妨動動手指在下方評論區留言，小V期待與你相遇。